PCR进阶——GCRich片段的扩增策略

　　PCR早已是分子生物学实验的常规技术，但是GC-rich扩增始终是有难度的应用。

　　以人基因组为例，大约3%的序列可划为GC-rich序列，尤其是在启动子，增强子等控制元件，GC-rich序列更为常见。因此，GC-rich片段的PCR扩增困难，也就阻碍了有关这类序列的科研进展。

　　GC-Rich片段案例：FMR1

　　脆性X综合征(Fragile X Syndrome)是一种X连锁遗传病，是最常见的遗传性智能障碍疾病之一，发病率仅次于唐氏综合征。致病原因是X染色体上FMR1基因(CGG)n扩展突变，导致维持脑部正常神经传导的FMRP蛋白缺乏，患者会有严重的智力低下、发育迟缓、语言障碍和行为问题，包括多动症、自闭症、注意力不集中和伴有癫痫等症状。

　　GC-Rich片段的扩增策略

　　在此先给出一般定义上的GC-Rich定义：Master P综合多种论文文献及产品技术文档等，对于一个片段内GC含量高于65%即可认为是GC-Rich片段。值得注意的是，根据个人经验，如果一个片段只有部分是GC-Rich，导致全部序列统计时并未显示GC-Rich——这需要更细心的序列分析，如使用Oligo软件等——这类片段的扩增也应归属于GC-Rich扩增。下图展示了两种不同的GC-Rich片段类型。

　　GC-Rich扩增困难的原因

　　模板变性更难：GC-Rich区域显然变性更不容易，可能存在变性不足的情况。

　　退火过程中变性的模板更容易复性：正如之前介绍的，引物-聚合酶-模板这“三位一体”（complex）要紧紧的在一起才能保证延伸进行。当这个三位一体遇到局部复性为双链的模板时，显然是不利于延伸的。

　　模板形成分子内的二级结构，干扰PCR的进行：上面两条是Master P推断的，此条有文献可查3。

　　dNTP的等浓度性：此条也是Master P推断的。通常PCR Master mix或者单酶产品中的dNTP mix中，四种单核苷酸浓度比例1：1：1：1，很像某龙鱼的调和油一样，人人生而平等。但是，扩增GC-Rich必然要使用更多的dCTP和dGTP，dNTP的掺入是一个随机的过程，即，酶-引物-模板复合体周围dNTP通过随机热运动，恰好进入酶催化部位的构象内，DNA链+1个核苷酸，那么，四种等浓度的dNTP客观上给这类扩增制造了“难度”。Master P有条件买到四种dNTP的单核苷酸溶液，并使用较高浓度的GC做过此类验证（Data not shown）。

　　GC-Rich片段的扩增策略

　　 引物设计策略

　　Li-Yan Li等4与高梅等5分别表了一篇关于GC-Rich 片段的引物设计方法。简单概来说，就是要将引物的Tm值设计的高一些，最好大于65℃，并且上下游引物的Tm值差（△Tm）要小，这种设计策略对扩增GC-Rich片段是有效的。

　　热循环参数设置策略

　　两步法：适合高Tm的引物，好处如前述，不会因为低的退火温度造成模板复性或者二级结构形成。且高退火温度有利于增强特异性（见核酸退火研究）

　　三步法：

　　在以下情况使用1，无法设计高Tm的引物，2，引物既定，不重新设计。3，GC%在70%以下。注意：三步法是次优选择，能使用两步法则不用三步法。