PCR需要注意的一些问题

PCR需要注意的一些问题
扩增长目的片段当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得zui佳产量）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增zui高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（带有3'-5'外切核酸酶活性）也可以扩增较长产物（≤12kb）。除了选用正确的热稳定DNA聚合酶，较长产物的扩增还需要改变标准步骤的延伸时间、变性时间、缓冲液pH。按1分钟/kb增加延伸时间使聚合酶完成合成。一般对于有效的超长PCR，延伸温度会低至68℃。因为延伸时间较长，对于20kb的模板高达20分钟，所有使用较高起始pH的缓冲液。如果pH将至低于pH7.0，DNA会脱嘌呤。为了防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，将在扩增前温度增加到94℃变性温度的时间限制为小于等于1分钟。引物使用标准方法所使用的同样的方法设计，使用18到24个碱基得到较好的产量。防止残余（Carry-over）污染PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。PCR产物纯化残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。包括多次酚：氯仿抽提及随后的PEG沉淀或异丙醇沉淀的纯化步骤虽然有效，但是耗费时间，且会丢失产物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分钟内从反应成分中纯化PCR产物。它对80bp到10kb很大范围的PCR片段都有效，有效回收95％的原有样品（图26）。扩增后PCR片段的纯化使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含约1μg扩增产物的完整PCR体系。引物36到40碱基长。将峰值反应纯化，对纯化前（泳道A）和纯化后（泳道B）的洗脱液水相使用琼脂糖凝胶电泳分析。部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳，和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。使用Maligen Gel Extraction System将目的产物从琼脂糖中纯化出来，这是一种基于硅土的，从凝胶中快速纯化DNA片段的技术。