PCR产物定量实验

DNA 标准 TE PCR 产物

荧光计 金属箔纸 微量离心管

方法 A: 荧光测定法

荧光测定法可以在纳克级范围精确定量。荧光计和 DNA 定量试剂盒许多公司都有出售。确定荧光计是否安装了适合于特定染料的激发和发射的部件至关重要。该方法在设计上适用于配有带蓝色 LED 光源的滤光设备、微池附加器、试管（TurnerDesigns) 和 PicoGreen dsDNA Quantitation 试剂盒（Molecular Probes) 的微型焚光计。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

LambdaDNA 标准（100ug/ml)

TE(10 mmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,pH7.5)

2. 核酸和寡核苷酸

纯化的 PCR 产物

3. 特殊设备

荧光计、金属箔纸、微量离心管

4. 其他

PicoGreen dsDNA Quantitation 试剂盒 (MolecularProbes，P-7589)

二、方法

1.准备标准浓度的 DNA。将 lul 标准的λ-DNA（100ug/ml) 稀释到 49ulTE 中，使准浓度的 DNA 的最终浓度为 2ng/ul；另取 3 个管，分别加入 60ng、20ng 、2ngDNA, 用TE 补至 50ul; 再准备一个空白对照，只加 50ulTE。

2.准备样品：通常 0.5ul 或更少的 PCR 纯化产物是足够的，用 TE 补至 50ul。

3.将 PicoGreen 试剂用 TE1:200 稀释，然后用铝箔纸包裹以避光，每一个 DNA 样和空白对照中加入 50ul 稀释的 PicoGreen, 混合均匀，黑暗条件下放置 5 min。

4.用荧光计读取空白对照，并用最高浓度的标准 DNA 校准，再测定其他标准样品，检测校准的线性，然后测量样品。

方法 B: 比较溴化物染色法

如果没有荧光计，可以采用琼脂糖凝肢电泳估測 PCR 产物的浓度，通过溴化物染色后条带的亮度与已知量的 DNA 进行比较，从而对 PCR 产物定量。高和低 DNA 量梯度标准（Invitrogen,10496016 和 10068013,respectively) 是较为有用的 DNA 量标准，其中所含的每一种 DNA 片段的物质的量相等，高分子量标准是 1~10kb，低分子量标准是 0.1~2.0kb。