PCR扩増实验

dNTP混合物基因特异的正向引物基因特异的反向引物单链cDNATaqDNA聚合酶RT-PCR缓冲液

PCR仪PCR管

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去除 RNA 酶的双蒸水

10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl₂)

2. 酶和酶缓冲液

TaqDNA 聚合酶（5U/ul)

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)

基因特异的正向引物（5umol/L)

基因特异的反向引物（5umol/L)

单链 cDNA(见第一部分）

4. 放射性复合物

[a^-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)

5. 实验器材

薄壁的 PCR 管

6. 专用仪器

可编程的 PCR 仪

二、方法

1. 准备 PCR 反应混合物。

由第一部分制得的 cDNA                      11ul

10XRT-PCR 缓冲液                              55ul

10 mmol/LdNTP 混合物                        44ul

5umol/L 基因特异的正向引物               22ul

5umol/L 基因特异的反向引物               22ul

5U/ulTaqDNA 聚合酶                            2.75ul

去除 RNA 酶的双蒸水                           387.75ul

[a^-32P]dCTP(10uCi/ul)                         5.5ul

2. 平均 50ulPCR 反应混合物分别放入 10 个薄壁 PCR 管中。

3. 带有热盖的适当的 PCR 仪（如：GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems)

上运行 PCR。PCR 扩增的循环参数如下。

94°C30s

退火温度 30s

72°C30s

35 个循环

4. 每次奇数脉冲循环后放在冰上取样，由第 15 个循环起始，到第 35 个循环终止。

5. 变性聚丙烯酰胺凝肢（6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素）上分析样品。每个样品上样

10ul。滤纸上干燥凝肢，用 Phosphorlmager 或 X 射线片和 densitometer 对产物定量，也可以将产物条带从凝胶上切下，通过闪烁记数仪定量。

6. 信号的对数（y 轴）对应循环数（x 轴）作图。选择处于线性范围中心的循环数在后

续实验中使用。