PCRArray简单实用的检测基因表达的高通量方法（一）

简介：什么是PCR芯片？ 实时定量PCR是检测基因表达最灵敏，最可靠的方法。通过在试验过程中，实时监测荧光染料的信号变化，反映样品中的基因拷贝数。实时定量PCR线性范围广（能达到5个数量级），因此可以检测同一样品中表达量极低的基因和表达量很高的基因。但是，由于实时定量PCR需要制备标准曲线和同时分析内参基因，因此，每次实验只能检测少数几个基因的表达水平，若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。   通过简单的，经过优化的实时定量PCR体系，如SuperArray的RT²Profiler^TM PCR芯片，研究者可以同时研究大量基因，既可以进行某些特别感兴趣的信号通路的研究，也可以作为验证芯片结果的方法。   为了获得理想的实验结果，PCR芯片面临以下挑战：高特异性，高灵敏度和可重复性。高灵敏度或低检出限，在样品的总RNA量少，基因表达量低的情况下，也能检测出目的基因。高特异性，扩增产物严格保证基因特异性，避免非特异性产物，如引物二聚体的产生。可重复性，通过标准化的反应体系和实验方法，使得多人多次重复实验均能获得可靠的基因定量结果。
PCR芯片实验操作步骤 采用PCR芯片进行实验只需2小时。PCR芯片实验过程如图1所示：首先将RNA样品反转录为cDNA第一链，作为PCR模板；接着，将模板加入到反应体系（RT² Real-Time^TM  SYBR Green PCR Master  Mix）中。在已经固定好基因特异性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反应体系，进行PCR反应。采用仪器配套的软件计算PCR芯片中的每个基因的循环阈值（Ct）。最后，采用△△Ct方法比较对应的两个样本中同一基因的表达量变化。通过分析看家基因Ct值的一致性，可确定合适的标准化方法。芯片所设置的对照，可以检测PCR体系中是否存在DNA污染，或者是否有影响反转录或PCR实验步骤的因素存在。     图一 PCR芯片实验流程