RNA的分离与纯化

包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。
RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。

一、RNA制备的条件与环境
为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。
从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。

二、总RNA的分离与纯化
由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。尽管对剪切力不敏感，但RNA具有碱易变性，需要严格控制pH值。另外，在DNA与RNA的提取过程中，酚与氯仿经常结合、交替使用，主要在于两者合用时去除蛋白的效果更好，而且氯仿还能有效抑制RNase的活性，通过使酚脱水防止mRNA的丢失，加速有机相与水相的分层，去除植物色素和蔗糖以及核酸样品中的痕量酚。少量异戊醇的加入，其目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫。由于高浓度胍类的使用，为防止SDS的沉淀，常改用十二烷基肌氨酸钠。对含量较低的样品，加入糖原可以提高RNA的回收率。
总RNA提取法中最常使用的是一步法。需要指出的是，目前常用的一步法均以异丙醇沉淀RNA，由于其选择性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的总RNA中含有的小分子量RNA较少，rRNA和mRNA所占的比例相应增高。当然，目前的研究重点不是小分子量RNA，而是分子量较高的mRNA，不必苛求真正的总RNA。
（一）(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法
(异)硫氰酸胍-酚氯仿法是经典的一步法，由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。该法与以前的(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法相比，具有简便、经济和高效的特点，能同时迅速地处理多个标本，且RNA的完整性与纯度均很高。目前仍用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。总RNA的产量取决于标本的起始量，每毫克组织总RNA的产量大约为4～7mg，每106个细胞大约为5～10mg。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA，而且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染，这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解，同时抑制RT-PCR反应，并通过结合到膜上而影响RNA杂交中的印迹步骤。脂肪组织RNA的提取可换用(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法。当多糖与蛋白多糖的污染比较严重时，可下一个方法，通过增加一个有机溶剂的抽提步骤并改变RNA的沉淀条件而加以消除。
（二）可同时制备RNA、DNA与蛋白质的一步法
该法是(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改进方法。它是以(异)硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞，然后加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。其中RNA沉淀溶液的成分为1.2mmol/L的NaCl与0.8mmol/L的柠檬酸二钠。由于RNA沉淀溶液的使用，该法制备的RNA样品极少有多糖与蛋白多糖的污染，可用于mRNA的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应等。处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分别分级沉淀出来。该法制备的DNA，大小约为20kb，可作PCR反应的模板，蛋白质样品则主要用于免疫印迹。目前，该法已有多种商品化的单相裂解试剂供选择，是最常用的总RNA提取法，其产率与(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相当。
（三）其它方法
RNA的分离纯化方法与方案还有许多，如(异)硫氰酸胍-CsCl超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、LiCl-尿素法、热酚法等，因各种原因目前已较少使用。

三、mRNA的分离与纯化

与大小和序列明确的rRNA、tRNA及核内小分子RNA不同，真核生物的mRNA在细胞中含量少、种类多、分子量大小不一。除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3'末端带有一个长短不一的多聚腺苷酸（polyadenylic acid）的结构，即poly(A)尾巴。以总RNA制品为起始材料，利用核酸的碱基配对原理，通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地同时分离不同种类与大小的mRNA的分子群体。理论上，它们可编码细胞内所有的蛋白质与多肽分子。
（一）oligo(dT)-纤维素柱层析法
oligo(dT)-纤维素柱层析法是mRNA制备的一个标准方法。它是以oligo(dT)-纤维素填充层析柱，加入待分离的总RNA样品，其中poly(A)+RNA在高盐条件下，通过碱基互补，与oligo(dT)-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂交体，洗去未结合的其它RNA，然后在低盐缓冲液中洗脱并回收poly(A)+RNA。从哺乳动物细胞提取大量的非放射性RNA 时，oligo(dT)-纤维素柱层析法是首选方法，回收的poly(A)+RNA量可达总RNA的1%～10%。但该法分离速度慢，易阻塞，不适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的poly(A)+RNA，故不适合对少量RNA样品的分离。
（二）oligo(dT)-纤维素液相结合离心法
为适应同时对多个标本进行处理的要求，应选用批量的层析法。oligo(dT)-纤维素液相结合离心法不经填柱，而是直接将oligo(dT)-纤维素加入到一系列的含不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附有poly(A)+RNA的oligo(dT)-纤维素，经漂洗后，用含70%的乙醇洗脱液将吸附的poly(A)+RNA从oligo(dT)-纤维素上洗脱并沉淀出来。该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA样品中分离出poly(A)+RNA。用本法分离poly(A)+RNA时，应选用等级较高的oligo(dT)-纤维素，如oligo(dT)18-30纤维素，而一般的柱层析填充的是oligo(dT)12-18纤维素。
（三）其它方法
磁珠分离法则联合利用了oligo(dT)与poly(A)的互补配对特性、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的特异性结合以及磁性分离原理，对poly(A)+RNA进行高效、灵敏、快速的分离（图6-4）。其产量甚至比常规的oligo(dT)-纤维素柱层析法还高，且分离的poly(A)+RNA能用于几乎所有的分子生物学实验。但它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1克，而且磁珠很贵并需要专门的磁性分离架。