RNA的制备(mRNA的分离和RNA酶活性的控制)3

A、细胞裂解
a．单层细胞的裂解
a)吸出培养液，以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复1次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。
b)直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液， 并使之遍布整个平板的表面。
RNA提取缓冲注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)
0.5％NP-40
1mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）
100单位/ml胎盘RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物
c)加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。
蛋白酶消化缓冲液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d)用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复 3－4次，剪切DNA。
c)加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。
蛋白酶K以贮存液的形式保存，贮存液为20mg/ml 蛋白K溶液。

b．悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a)于4℃以2000g离心5分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀，洗涤细胞3次，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀，使其彻底分散。
b)估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。
c)加入与步骤b)所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
d)加蛋白酶K至终浓度为 200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存，贮存液为20μg/ml蛋白酶K水溶液。
B、提取步骤
1）用等体积酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白质。
2）用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至一个新的离心管内，加2.5倍体积用冰预次序的乙醇，充分混匀， 于0℃放置1小时。
3）于0℃以5000g离心10分钟沉淀 RNA，弃上清，用含0.1mol/L 乙酸钠（pH5.2）的70％乙酸洗涤沉淀，用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽， 随后于室温放置几分钟，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因为干的核酸沉淀很难溶解。
4）每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加 200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。
5）分别按 10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫苏糖醇（DTT），然后分别按1000单位/或10mmol/L 的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。
6）加入无RNA酶的胰DNA酶I至终浓度为2μg/ml，混匀，于37℃温育60分钟。
7）分别按 10mmol/L和0.2％的终浓度加EDTA和SDS。
8）用等体积酚：氯仿抽提1次。
9）于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至另一个离心管内，加3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L，加2.5倍体积用冰预次的乙醇，充分混匀，冰浴放置2小时。
10）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟沉淀RNA。
11）吸出所有的乙醇，将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发干净。
12）用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃贮存备用。回收DNA时，只须取出1小份贮存液，加入3mol/L乙酸钠（pH5.2 ）至终浓度为0.3mol/L，充分混匀，用微量离心机于4℃以12 000g 离心5分钟即可。

C、注意事项
1．测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/TE混合液离心沉淀RNA，以400水重溶， 测定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升约含40μg RNA。
2.如果需要，可用 oligo(dT) －纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。
3.某些情况下（例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA时），必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则，当用这种RNA构建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题， 反转录过程中法染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物，从而导致物定mRNA5’末端定位的错误或产生截短的 cDNA克隆。
a)步骤12后，加200μl 3mol/L乙酸钠（pH5.2），用自动微量移液器反复吹吸，以重悬核酸沉淀，将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。
b)用微量离心机于室温以12 000g离心10分钟，RNA沉于管底，而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。
c) 弃上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠（pH5.2），分混匀，加入550μl用冰预冷的乙醇。混匀溶液， 在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于4℃以12 000g离主10分钟，以回收RNA。小心吸出上清。d)弃上清液，用 300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃贮存备用。
回收RNA时，只需取出1小份贮存液，加3mol乙酸钠（pH5.2 ）至终浓度为0.3mol/L充分混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物，用含0.1％羟喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]将RNA终溶液抽提数次即可。
4. 对大多数细胞株来说， 一个直径 90mm 培养甲中培养的RNA收率为100-200μg。用异硫氰酸胍和有机溶剂提取ＲＮＡ
收集细胞，离心5000r/min ，5分钟，弃上清，加入异硫氰酸胍变性液（异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠25mmol/L，Sarkosy10.5%,β-巯基乙醇0.1mol /L）500ml，混匀，振荡10秒，加2 mol/L醋酸钠50ml，水饱和酚500m l和氯仿/异戊醇（49：1）100m l颠倒混合数秒钟，冰浴15分钟，4℃离心10,000 r/min，15分钟，吸取上清，加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，4℃离心10,000 r/min，10分钟，弃上清，70%酒精洗涤一次，抽干，加35mlDEPC处理水溶解，取5ml经稀释后紫外测定RNA提取量，其余30ml分装，-20℃保存备用。