RNA提取与纯化

实验概要

掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。

实验原理

RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。
 

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。
 

RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。
 

判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。

主要试剂

1、暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3 h

2、DEPC

3、DEPC处理的ddH2O

4、RNA提取液：（每1000毫升中含有） 

    Tris   6.06 克   (最终浓度为50 mM )

      LiCl  6.03 克 (LiCl -H2O 9.06克)(最终浓度为150 mM )

      EDTA（0.5 M）  10 毫升   (最终浓度为5 mM )

      SDS             50 克(最终浓度为5 % )

5、8 MLi Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC处理的ddH2O

6、水饱和酚

7、氯仿

8、0.5M NaCl

9、溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

10、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。

主要设备

1、分光光度计

2、电泳仪

3、台式离心机

4、手提式紫外监测仪

5、恒温水浴

6、凝胶成像系统

实验材料

暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3 h

实验步骤

1、取植物叶片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分装，小量提取试剂量可减至1／10)

2、液氮挥发完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中，迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。

3、立即加入10毫升的等体积（酸性）酚/氯仿，剧烈（！）反复倒置混匀5至10min（如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！）。

4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。

5、重复步骤3和4，三次左右（注意观察界面上白色物质）。

6、取上清，加入等体积的氯仿，反复倒置混匀2-5min。

7、13000g×5min。

8、取上清，加入1/3体积8 M 的 LiCl （即8 M LiCl应占最后体积的25%）， 沉淀RNA，4℃过夜。

9、离心13000g × 10 min。

10、弃上清,保留沉淀（此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%无水乙醇 30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟（和缓地反复倒置混匀），离心 （13000g × 2 min）。重复洗涤沉淀数次。

11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀，去掉盐离子。

12、用枪头吸去残留的液体，真空干燥2min。

13、加入200 ul DEPC 处理过的水溶解RNA。

14、取用5 ul电泳检测RNA完整性,  用TEB 缓冲液, 200V× 20-30min。

15、取5 ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度，A260 nm /A280 nm应在 2.0 左右。

16、将RNA 分装,放在-70℃长期保存备用.

注意事项

辅助方案：试剂盒提取法（Trizol）

（一）试剂：

    1.Ttizol Reagent 

2.氯仿

3.异丙醇

4.70%无水乙醇

5.DEPC  

（二）器材：

1、研钵

2、离心机

（三）实验步骤

1、称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。

2、加入1 ml Trizol  Reagent，15～30℃×5min。  

3、加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。

4、冷冻离心12 000 rpm×15min。

5、将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀 ，-20℃放置20min。

6、冷冻离心12 000 rpm×10min。

7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，悬浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。

8、加入30 ul DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。