RNA光谱分析与定量

DEPC 无核酸酶的水

紫外分光光度计 石英比色杯

一、材料与设备

1）紫外分光光度计。

2) 石英比色杯。

3)DEPC

4) 无核酸酶的水。

二、操作方法

(一）准备分光光度计

用 0.1%DEPC 水浸泡比色皿至少 15 min。

2) 用水或无 UV 吸收的缓冲掖设置基线。

3) 用水或无 UV 吸收的缓冲液稀释 RNA 样品，并进行检测

4) 记录样品在波长为 230nm、260nm 和 280nm 处的吸收值，并打印 200〜300nm 的扫描曲线。

(二）分光光度扫描曲线的分析

在-些情况 1F 有必要通过扫描分析而了解污染程度，而不是仅仅测定 260nm 和 280mn 的吸收值。抽提后残留的微量酚、硫氰酸胍的扫描图有明显的差别，A₂₆₀:A₂₈₀ 的值会有细微差别，m 仍属于可接受的范围，而 RNA 浓度会苻显著的改变。

由此，当用分光光度法分析 RNA 比值和浓度时，不仅要考虑 280nm,260nm，230nm 的吸收值，而更要在 200〜300nm 范围内进行扫描，在抽提 RNA 过程中所用试剂的微量残留物能够影响并误导测定结果, 继而影响后续试验

(三）RNA 定量

根裾 RNA 样品在 260mn 处的光吸收值和样品的稀释倍数，紫外分光光度计可以直接测出样品的浓度，也可以按下式汁算：RNA 浓度 (ug/ml)=（A₂₆₀X 稀释倍数)/(0.024XL) 式中：A₂₆₀ 为 260mn 波长处光吸收值；L 为比色池厚度，一般为 1 cm 或 0.5 cm;0.024 为每毫升溶液内含 1ugRNA 的光吸收值。当比色池厚度为 lcm，样品 A₂₆₀ 为 1 时，RNA 的浓度约为稀释倍数 X40ug/ml。

1) 整个操作过裎中应戴手套，尽量减少外源性 RNase 活性的影响。

2) 通常建议用凝胶电泳而不用分光光度法分析 RNA。因为电泳不仅能显示 RNA 的完整性，而且在多数情况下，能显示 RNA 的种类，如原核细胞的 18S/23SrRNA 和真核细胞的 18S/28SRNA

3) 根据用 EB 对条带的分析可以大致确定 RNA 的浓度。

4) 除此之外，还可以通过荧光染色和 Agilent2100 生物分析仪对 RNA 样品进行定量和完整性的分析。一些荧光染料，如RiboGreen，与核酸结合后其荧光强度显著增强, 浓度为 lng/ml 的 RNA 经 RiboGreen 染色后可用荧光分析仪检测和定量。对 RNA 进行精确定量时，可先用已知浓度的样品设置标准曲线，当使用两种不同染料浓度时，用 RiboGreen 定最的线性范围包括三个数量级 lng/ml〜lug/ml)。并且，RiboGreen 分析方法对样品中的非核酸物质相对不敏感，因此_浓度与吸光值具有线性关系。使用该方法时应注意以下几点：首先，RiboGreen 不能区分 DNA 和 RNA，因此要用无 RNase 的 DNase 去除 DNA; 其次，RiboGreeii 能够吸附在试管壁上, 要用非吸附的、无核酶的聚丙烯塑料管; 再次，为了避免 RiboGreeii 试剂被光降解，应避光保存试剂，并在制备后的几小时内使用；最后，应避免反复冻融 RNA 标准品，以免引起 RNA 链的剪切从而降低与染料的结合能力。另外，在核酸浓度低时，反复冻融会使其吸附在管壁上

5)Agilent2100 生物分析仪结合毛细管电泳、荧光染色等技术，能够对 RNA 进行定量和完整件分析□其最大的优势在于对 RNA 完整性的分析，它能显示 18S 和 2SS 核糖体 RNA 的峰值和比例；另外，它对 mRNA 和 aRNA （tantisenseRNA) 的完整性分析也很有特点，完整的 mRNA 和 aRNA 主要由 lkb〜2kb 之间的条带组成，如果出现较多的低分子质量条带, 则意味 RNA 的完整性较差。