RNA的Nouthern印迹和狭线杂交分析实验

RNA

DEPC MOPS 甲醛 琼脂糖 乙酸铵 NaOH NaCl Tris·Cl 磷酸钠 溴化乙锭 SDS

离心机 电泳仪 培养箱 紫外线透照仪 杂交炉

1.  用72 ml 水溶解1 g 琼脂糖，在水浴中冷至60℃时，移至通风橱中加入10×MOPS电泳缓冲液和18 ml 12.3 mol/l 甲醛。

2.  铺制凝胶使之凝固，拔去梳子，将凝胶放进电泳池，加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1 mm 左右。
 

3.  将每份样品的体积用水调整至11 μl，然后加入：

（1）5 μl  10×MOPS电泳缓冲液

（2）9 μl  12.3 mol/l 甲醛

（3）25 μl  甲酰胺

（4）在漩涡混合器振荡混匀，并在微量离心机中短暂离心5~10 s 回收液滴，然后在55℃保温15 min。

4.   加入10 μl 醛加样缓冲液，在旋涡混合器中振荡，并在微量离心机中稍加离心以回收液滴。

5.  每分样品在一对加样孔中分别加入0.5~10 μg RNA样品，以便可取半片凝胶进行染色显。

6.  在5 V/cm 电压降下电泳至溴酚蓝染料泳动了凝胶长度的一半或三分之二。

7.  用溴化乙锭染色

（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。

（2）放置于无RNa酶的玻璃平血，加 入足够量的0.5 mol/l 乙酸铵覆盖，浸泡20 min 换液再泡20 min 以除去甲醛。

（3）倾去液体，加入含0.5 μl /ml 溴化乙锭的0.5 mol/l 乙酸铵，染色40 min。

（4）必要时以0.5 mol/l 乙酸铵脱色1 h。

8.  用吖啶橙染色

（1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。

（2）在含10 μg/l 吖啶橙的1.1 mol/l 甲醛/10 mmo/l 磷酸钠中染色2 min。

（3）在不含吖啶橙的同样液体中脱色20 min。

9.  在紫外线透照仪中使凝胶中的RNA显迹，沿凝胶的边缘放一把尺子拍照，以便随后能确定膜中的条带。

10.  将非染色的部分凝胶放置于无RNA酶的玻璃平皿，加足够的去离子水浸洗几次以除去甲醛。

11.  凝胶浸泡在10倍体枳的0.05 mol/l NaOH/1.5 mol/l NaCl中30 min，使RNA部分水解。

12.  接着浸泡于10倍体积的0.5 mol/l Tris·Cl（pH7.4）/1.5 mol/l NaCl缓冲液中和30 min。

13.  将溶液换成10倍体枳的20×SDS，浸泡45 min。

14.  在玻璃或塑料平皿中放置一比凝胶略大的矩形海绵（必要时，可并排放两块或更多）加入足够的20×SDS以使海绵半淹没在液体中。

15.  构筑转移平台，剪3张与海绵同样大小的Whatman 3 MM 滤纸，放在海绵表面，并以20×SDS润湿。

16.  把凝胶置于滤纸表面，用玻璃吸管在其表面滚动挤压去除气泡，切4条塑料保鲜瞋覆盖在凝晈的边缘。

17.  剪一片与凝胶暴露面枳大小相当的尼龙膜或硝酸纤维素胶膜，在一个无RNA酶的玻璃平皿中加入约0.5 mm深的去离子水，将膜漂住水面使之润湿，直至膜沉没在水中。

18.  如果是尼龙膜，只需让膜在水中泡上5 min，如杲是硝酸纤维素膜，换成20×SDS再浸泡10 min。

19.  将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以20×SDS洗膜表面。

20.  切5张与膜大小相 当的Whatman 3 MM 滤纸，放于膜的表面。

21.  然后将切得如膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高约4 cm。

22.  在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物（0.2~0.4 kg），放置过夜。

23.  拆卸转移装置，回收膜和压扁了的凝胶，在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。

24.  用2×SDS洗膜，然后放在一张Whatman 3 MM 滤纸上，让膜完全干燥

25.  硝酸纤维素膜的处理：将膜夹在两张Whatman 3 MM 滤纸中，80℃真空烤膜2 h。

26.  尼龙膜的处理：如上述方法烤膜或将干的膜包在能透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外线透照仪照射合适的时间。

27.  如需要的话，凝胶可按步骤7或8操作，用溴化乙锭或吖啶橙染色以检查转印效率，或在含0.03%（w/v）亚甲蓝的0.3 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液中染色45 s，在水中脱色2 min。

28.  制备放射比活在10⁸ dpm 以上的寡核苷酸探针，并除去未标的寡核苷酸。

29.  用6×SSC液润湿携带RNA的膜。

30.  将膜带RNA的面朝上，放入杂交管中，毎10 cm² 面积加入1 ml 甲酰胺预杂交液/ 杂交液，杂交管在杂交炉中旋转保温3 h 温度设定在42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）。

31.  如果是双链探针的话，需在水浴或加热器中加热至100℃，保温10 min，移至冰上。

32.  吸所需要体积的探针加入杂交管中，在杂交炉中于42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）旋转过夜。

33.  倒出杂交液，按以下程序依次洗膜：

（1）2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min。

（2）0.2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min（低严谨度洗涤）。

（3）于42℃预热0.2×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（中严谨度洗涤，可选）。

（4）于68℃预热0.1×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（高严谨度洗涤，可选）。
 

34.  在室温以2×SSC洗膜，吸干多余液体，盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，并进行放射自显影。