RNASPLIT技术是揭开XistRNA扩展的关键机制的可视化工具

　　越来越多的研究开始使用活体成像的方式观测生物体内各种反应的全过程，比如细胞去分化以及组织再生等，以期为多种生物学过程增加时间轴上的信息。X染色体失活（X chromosome inactivation，XCI）现象是哺乳动物中XX雌性为了维持X连锁基因表达与XY雄性相等的水平而出现的机制。X染色体失活过程由非编码RNA Xist（X-inactive specific transcript）所控制，在X染色体失活的选择过程中，Xist以顺式积累的方式招募染色质基因沉默所需要的因子驱动X染色体的失活。但是一直以来，Xist在染色体区域中是如何扩展的还是X染色体失活研究领域的“黑匣子”，以及在此过程中Xist RNA结合蛋白是如何参与其中的也很不清楚。因此，对于此过程进行全记录的需求呼之欲出。为此，英国牛津大学Neil Brockdorff研究组与Lothar Schermelleh研究组合作在Science发表论文，题为Time-resolved structured illumination microscopy reveals key principles of Xist RNA spreading，建立了可以对单个Xist分子进行活体成像追踪的RNA-SPLIT 技术，为揭开Xist RNA扩展过程的关键机制提供了重要的可视化工具。

　　为了对单个Xist分子进行3D-SIM超分辨成像，作者们将Bgl茎环结构系统引入到对于Xist RNA的标记中。在2020年，Nature曾经报道过SPEN对X染色体失活过程影响的表观遗传分子机制，其中就利用了Bgl-BglG-GFP的茎环结构系统。作者们在Xist的3’末端加上了18个拷贝的Bgl茎环结构，Bgl茎环结构可以被BglG蛋白紧密结合，在此系统中作者们同时引入了HaloTag（图1）。HaloTag技术的引入会增加该系统的光稳定性以及图像采集的亮度，使其足以应用于3D-SIM光学切片，这使得作者们得以在三维空间内亚核区域内检测聚集的Xist信号，作者们将该区域称为Xist域（Xist territory）。

　　图1 RNA-SPLIT系统：Bgl-BglG-GFP茎环结构与HaloTag联用的顺序脉冲定位成像系统

　　在建立好RNA-SPLIT（Sequential pulse localization imaging over time）的实验体系后，作者们对Xist域扩展的过程进行了成像记录。在此过程中，作者们鉴定发现Xist域形成过程中包括两个关键时间阶段，从诱导产生Xist RNA开始的1.5-5小时，Xist域的信号逐渐增加，作者们将该时相称为Xist域的扩展阶段（Expansion phase）。而在随后的时程中Xist的呈现一种相对稳定的状态，被称为稳定阶段（Steady state）。作者们使用3D-SIM成像发现在Xist RNA扩展阶段，细胞中Xist RNA的数量为每个细胞中50-200个，这与先前的报道是一致的。说明了RNA-SPLIT系统的稳健性与精确性。

　　由于3D-SIM使用较慢的帧速进行成像会造成小鼠胚胎干细胞生长变慢，为了克服这一缺陷，作者们对RNA-SPLIT系统进行了进一步的优化（图1），采用的方式是在细胞培养过程中进行多轮的HaloTag标记，使得可以分别标记不同时间合成的RNA，并且也可以通过固定对已合成和新合成的Xist RNA进行分析。该方式可以对Xist RNA在扩展过程中的稳定性、周转速率、定位以及动态变化进行研究。通过对Xist RNA延伸和扩展的时间分辨上的分析，作者们发现Xist RNA扩展的速率为~8μm3/小时，首次以量化的形式对Xist RNA的扩展进行了描述和定义。另外，通过3D-SIM对顺序处理实验RNA-SPLIT进行成像，作者们发现已合成的Xist与新合成的Xist之间存在显著的偶联（Coupling）存在的关系，无论是通过活体成像还是通过原位杂交的实验，作者们的实验证据都证实了这一点。

　　既然有了如此有效的高分辨率活体成像工具，作者们进一步希望对顺式调控Xist RNA定位的一些因子调控Xist的机制进行更精确地验证和分析。其中Xist定位主要的顺式调控因子中是CIZ1以及SPEN。CIZ1与Xist RNA之间存在相互作用，并且对于Xist分子在体细胞X染色体上的锚定非常关键。为了对CIZ1对Xist RNA的调控作用进行解析，作者们构建了一个Ciz1的敲除小鼠胚胎干细胞品系。在敲除Ciz1后，作者们发现Xist中的分布呈现显著性地分散特点（图2）。另外，通过进一步对Xist的转录以及RNA稳定性分析后，作者们发现Ciz1敲除的小鼠胚胎干细胞中Xist的分散分布主要是由于Xist转录与周转之间的反馈机制被破坏。另外，通过构建SPEN的RNA识别基序的突变体以及表观遗传修饰相关的SPOC结构域引入突变等方式，对SPEN对Xist RNA在X染色体失活中的作用进行研究，发现SPEN对于Xist RNA的定位非常关键。

　　图2 CIZ1敲除后Xist RNA在细胞核中的分布显著分散

　　总的来说，该工作在Xist RNA在X染色体失活过程中作用给出了两种新的见解。第一，作者们通过构建RNA-SPLIT成像的技术揭开了Xist分子在Xist RNA扩展过程中存在扩展阶段以及稳定阶段两种状态，这两种状态表明Xist RNA存在合成与降解的反馈机制。第二，作者们通过多次进行HaloTag的处理，发现新合成与已合成的Xist RNA之间存在空间上的共定位，也就是偶联存在的关系，对Xist RNA的行为特点进行了进一步的指征。同时RNA-SPLIT技术的建立也加深了对CIZ1和SPEN等因子对Xist RNA行为和定位等不同方面调控机制的理解。因此，该工作为揭开Xist RNA的控制X染色体失活的体制提供了更为可视化、定量化的工具与证据。