RNAi治疗新进展:有望治愈致命遗传病

一种siRNA分子(紫色和绿色部分)可能治疗遗传性肝脏疾病

　　RNA干扰(RNAi)，基因沉默技术的一种，显示了疾病治疗的巨大潜力，但从来没有人能确切证实它对疾病治疗所能发挥的作用。但是现在RNAi已经逐渐获得了研究人员的一致好评。一项新的研究表明，该方法能够显著并安全地削弱导致一种罕见的肝脏疾病的蛋白质的表达水平。

　　我们的细胞依赖RNAi来关闭特定的基因，这种发挥作用的RNA分子通常较小，例如microRNA和siRNAs。上个世纪90年代末，研究人员就发现了这个过程，他们已经开始几十个临床试验，以衡量这些小分子RNA的注入能否抵抗一系列的疾病，例如肺部感染、肝癌、黄斑变性等。虽然有些结果是令人鼓舞的，但是RNAi的安全有效剂量尚不清楚。

　　在新的研究工作中，葡萄牙的神经学家Teresa Coelho和同事们测试了甲状腺素运载蛋白淀粉样变性患者的RNAi效果，甲状腺素运载蛋白淀粉样变性是一种致命的遗传疾病，患者的肝细胞会产生过量的运甲状腺素蛋白。通常情况下，运甲状腺素蛋白通过血液运送激素，额外的蛋白质就积聚在神经、心脏和身体其它部位。虽然肝移植可以延长一些患者的生命，可该疾病仍然是无法治愈。

　　科研小组为24名转甲状腺素蛋白淀粉样变性患者注射了能够抑制细胞蛋白质生产的siRNA。因为破坏RNA的酶存在于细胞间隙，因此这些用于注射的siRNAs被夹带在微小的脂滴中，这就是众所周知的脂质纳米粒子。作为实验的对照，一部分患者被注射了生理盐水。此外，研究者还选择了一组健康的受试者，为他们注射了一种携带同样siRNA但稍有不同的脂质纳米粒子。

　　对于转甲状腺素蛋白淀粉样变的患者，siRNA治疗7天后，转甲状腺素水平下降了38%，这一研究成果近日在线发表在The New England Journal of Medicine期刊上。对于健康对照组的受试者，他们在接受改造脂质纳米粒子的注射后，转甲状腺素水平有了更大的下降，平均高达87%。这些结果表明，肝细胞吸收脂质纳米粒子，siRNAs被释放，从而减少了转甲状腺素输出。研究人员形容这是一个“重要的减少”，但研究人员并没有确定的siRNA是否减缓病情进展。因此在接下来15个月里对这些美国、欧洲和南美患者的随访调查中，这一指标将被测定。

　　研究人员同时指出，有些患者会出现过敏样的反应，例如潮红、胸闷等症状。但是如果这些纳米粒子的传递停止后，这些症状一般就会自动逐渐消失。

　　“研究报告明确显示，利用RNAi疗法，人们可以减少作用如此强大的蛋白，这将打开药用RNAi的大门。” 得克萨斯大学西南医学中心的分子生物学家David Corey说。

　　加利福尼亚的分子遗传学家John Rossi认为，siRNAi治疗也可以对抗其它肝脏疾病，但他警告说“由于脂质载体主要针对肝脏，但是如果利用类似的方式治疗非肝脏疾病，效果也许不明显。”

　　控制如转甲状腺素蛋白淀粉样变性一类的疾病大概需要几年时间的多次治疗，因此，研究人员还需要确定siRNA脂质纳米粒子是否长期安全有效。

　　RNAi技术简介

　　RNAi 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi是在研究秀丽新小杆线虫(C. elegans)反义RNA的过程中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，研究人员发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，但当时这一现象没有得到合理的解释。1998年，研究人员发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，这一现象被命名为RNAi。

　　病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅速产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将 dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(21-23 bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶，例如内切酶、外切酶、解旋酶等，结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，并在结合部位切割mRNA。被切割后的断裂 mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在 RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶 mRNA完全降解。

　　RNAi的应用

　　探索基因功能：在RNAi技术出现以前，基因敲除是主要的反向遗传学研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。

　　基因治疗：RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有 BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

　　外科整形：已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，目前尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-βⅡ型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和Ⅲ型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子TIMP-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。

　　病毒性疾病治疗：加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HⅣ-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞，而不影响另一种H Ⅳ-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HⅣ-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对 Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。

　　遗传性疾病治疗：美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi同脆性X染色体综合征(与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病)之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。

　　肿瘤治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。尽管化疗能有效消灭肿瘤细胞，却不能有效的靶向肿瘤细胞，因此，在治疗过程中导致很多正常细胞的死亡，实现靶向肿瘤细胞同样也是以RNAi为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。RNAi代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比，RNAi设计更简便、作用迅速、效果明显，其技术优势还在于能根据不同病情，设计个体化治疗方案。