ROS检测方法总结

活性氧（reactive oxygen species，ROS）指来源于氧的自由基和非自由基，包含了超氧阴离子（O2•-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）、臭氧（O3）和单线态氧（1O2）等，由于它们含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性。

ROS在细胞生命，应激和死亡中具介导作用，并且不同浓度的ROS在其中起着截然不同的作用，从而导致细胞命运的不同。因此，非常有必要对ROS的浓度或相对水平进行可靠的测量。

1、电子顺磁共振技术(EPR)

2、荧光染色法

3、化学发光法

4、色谱方法

5、分光光度法

6、电化学生物传感器

7、基于荧光蛋白的方法

1、电子顺磁共振技术 ( electron paramagnetic resonance , EPR )

EPR是一种检测自由基的波谱学方法,是明确评估生物系统中以氧气为中心的自由基生成的“金标准”。由于O2•-,•OH反应活性高、寿命短EPR信号不易直接检出, EPR与自旋捕获技术( spin tranps )相结合可弥补这一缺陷。首先自旋电子捕获剂与自由基发生反应生成EPR易检的相对稳定的自由基附加生成物,然后用EPR技术进行测定。它是一种功能强大且可靠的技术，可以明确地测量生物样品中的O2•-，•OH和NO。

2、荧光染色法

荧光探针通常对氧化剂敏感，并且在被氧气氧化之前是非荧光性的。使用最广泛的成员是二氢乙啶（DHE），二氯二氢荧光素（DCFH-DA）和Amplex Red（尽管细胞不可渗透）。细胞可渗透的物质有助于反映细胞区室的氧化状态，提供有关刺激下自由基产生的信息。这些探针大多数通过单电子自由基机理被氧化，产生探针自由基中间体并产生荧光产物。DHE能够进入细胞并被细胞内O2•-氧化形成特定的红色荧光2-羟基乙啶（2-OH-E+），或可以被其他氧化剂（•OH, H2O2, or OONO-）氧化生成非特定的红色荧光乙锭（E+），2-OH-E+和E+均可通过基于荧光的技术任意捕获。DCFH-DA通常用于直接测量细胞内的氧化还原状态。它能够进入细胞并被酯酶水解成不可渗透膜的DCFH，它可以在内部扩散并被非特定的氧自由基氧化，从而通过非荧光的中间自由基DCFH生成荧光的DCF。Amplex Red用于检测过氧化氢。

3、化学发光法

化学发光分析通常用于超氧化物的检测。与荧光分析类似，化学发光探针对自由基敏感，易于操作。探针可以与O2•-形成光子，并由光度计吸收计数器捕获，而无需使用激发光光源。反应涉及多个步骤，并且探针自由基中间体在该机制中也起着关键作用，因此发光探针的局限性也与荧光探针类似。常用的化学发光试剂有鲁米诺( luminol )、光泽精( lucigenin )、甲壳动物荧光素(如海萤荧光素)等。

4、色谱方法

色谱法用于羟基自由基及其反应产物的分离和鉴定。•OH与特定的试剂反应，生成可通过色谱分析检测到的稳定化合物，其中通常使用液相色谱及其与质谱的组合。通常用于稳定自由基的试剂是苯甲酸，水杨酸和DMSO。水杨酸与羟基自由基反应生成的2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHBA）和2,5-二羟基苯甲酸（2,5-DHBA）通过HPLC并使用电化学检测器进行定量，证明此方法可用于体内测量羟基自由基。基于HPLC的方法已应用于许多反应系统和组织中的羟基自由基或抗氧化剂活性的检测

5、分光光度法

分光光度法是检测ROS的悠久方法。它们基于自由基和氧化还原物质之间的反应而起作用，并且底物和产物之间在不同波长下的吸光度差异使自由基的半定量化成为可能。最常用的方法有细胞色素C ( cytochrome C )的O2•-还原法和氮篮四唑( nitro blue tetrazolium , NBT )还原法。

6、电化学生物传感器

由金丝电极上的细胞色素c和聚苯胺（磺酸）的交替层形成的电化学生物传感器（如下图）用于超氧化物的定量。

7、基于荧光蛋白的方法

基于荧光蛋白的氧化还原探针是通过荧光蛋白（FPs）和原核氧化还原敏感蛋白的组合而设计的。重组蛋白通过质粒或腺病毒被引入细胞，并靶向亚细胞器，从而报告某些区域的氧化还原状态。重组蛋白的氧化还原依赖性荧光光谱变化是通过在氧化条件下二硫键和部分主链的结构变化实现的。