RTPCR反应原理

RT- PCR反应原理

1. 从细胞或特定组织中提取总RNA。

2. 逆转录实验。

3. 扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。

RT-PCR反应受多个因素影响，
如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。

 

　　◇建议选择0.5-3.0 mM （相差0.5 mM）的硫酸镁作初步实验。

 

　　◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。

 

　　◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。 

随机引物	适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
Oligo dT	适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。
基因特异性引物	与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。