RTPCR扩增目的基因cDNA

实验概要

学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

实验原理

普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（d T）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

主要试剂

1、RNA模板

2、cDNA引物

3、反转录缓冲液

4、dNTP

5、AMV反转录酶

6、RNA抑制剂（RNasin）

7、Taq酶

8、10×PCR缓冲溶液

9、引物（P1、P2）

主要设备

1、PCR扩增仪

2、电泳仪

3、台式离心机

4、恒温水浴

5、紫外分析仪

6、微量移液器

实验步骤

一、RNA的反转录

1、在小管中依次加入

5 ul RNA 

6 ul DEPC H2O 

混合后,65℃×5 min(破坏二级结构). 

2、置于冰浴5 min.

3、在管中依次加入: (反应体系为20 ul)  

RT buffer ( 5×)4 ul 

RNasin0.5 ul 

dNTP ( 10mM)2 ul

Oligo T17A（G／C） （50-100 uM） 1 ul

AMV反转录酶1 ul 

置于 42℃× 1 h。

4、70℃× 5 min（使酶失活，可省略）。

5、加入100ul ddH2O (从总RNA开始制备)或1000 ulddH2O（从mRNA开始制备）。

6、置于-20℃保存备用.
 

二、PCR扩增DNA

在灭菌的0.5ml PCR管中，依次加入

20μl              cDNA

10μl              10×PCR buffer

5μl               dNTP

2μl               RT引物I

2μl               RT引物II

1μl              Taq DNA聚合酶

加ddH2O 补足50μl ，混匀。

PCR程序：

                             94 ℃        3 min        

                             95 ℃        30 s

         35 cycles:     55 ℃        60 s

                             72 ℃        90 s                

                             72 ℃        10 min
 

三、PCR产物的鉴定

取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。