RainDrop数字PCR系统实现10重PCR分析

　　【摘要】美国RainDance Technologies公司拥有ZL的RainStorm即皮升级微流体液滴制备技术，基于此核心技术RainDance推出了新型RainDrop 数字PCR系统，这一新型系统除具有超高检测灵敏度和精确绝对定量能力外，更拥有无与伦比的多重分析能力，可实现10重PCR分析。

　　数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比，数字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，将几十微升的反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系。核酸模板在这种分液的过程中被充分稀释，理想状态下每一个小反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。对于RainDrop数字PCR来说，基于其ZL的RainStorm技术，RainDrop系统能够将50微升PCR反应体系快速、均一地制备成1000万个皮升大小的油包水液滴，确保了真正的单分子扩增。分液完成后，收集所有液滴进行常规的PCR扩增。和qPCR不同，数字PCR不对扩增过程进行实时监测，而是检测end-point的荧光信号。扩增完成后所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到绝对定量的结果。

　　目前在基因组学和遗传学领域，对高通量同步分析多个目标的需求不断提升，同时在医药相关的如诊断领域，也需要更高效的利用有限量的样品，因而在同一反应体系中进行多重反应和定量多种目的片段，是PCR技术发展的主导方向。现有的qPCR系统大多可支持同步检测4种荧光素，然而由于多重引物和探针的组合对PCR反应动力学的影响，现实中多重分析通常难以实现，或需要进行复杂的条件优化。

　　RainDrop数字PCR具有VIC和FAM双通道荧光信号检测系统，其荧光信号的获得是基于Taqman探针原理，通过调整此两种荧光素探针的使用可以轻松地实现多重分析。基本原理如下示意图（左）：针对多个目的片段分别使用VIC标记、FAM标记或混合两种荧光素标记的探针，检测时带VIC荧光、FAM荧光或同时带两种荧光的液滴将被相应辨识出来，分别被计数。基于此原理，在保证荧光信号强度与探针浓度成正比的前提下，调整荧光素的浓度以及调整两种荧光素混合时的配比，可以在一个反应中达到多至10重的分析（右图）。

　　一篇发表在Lab Chip上的文章中，RainDance公司和法国斯特拉斯堡大学的研究人员合作，实践了应用RainDrop系统进行多重分析。文章作者在对脊髓性肌肉萎缩症（spinal muscular atrophy）研究中，利用一个5重反应实现了对导致此病症的几个重要因素的同步检测，其中包括了检测基因缺失（SMN1）、基因拷贝数变化(SMN2)，以及关键基因上可能的点突变(SMN1 c.815A>G) (结果见下图)。

　　这一应用实例充分显示了RainDrop系统进行多重分析的潜力，5重分析已经突破了当前qPCR技术和其他数字PCR系统的极限。目前数字PCR还存在一些高通量限制，一个反应中的多重分析不仅确保了数据信息的完整性，无疑也大大提高了通量、降低了成本。

　　引用文章出自：Lab Chip, 2011, 11, 2167