RealTimePCR实验流程

实验试剂

Total RNA Kit ：Omega：(Cat.No．R6834)

First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No．C0210A)

2xAllinOneTMQ-PCRMix：GeneCopoeia（cat.No．D0101A)

Primer synthesis：invitrogen

实验设备

Real Time PCR：ABI

实验材料

样品为5个人源的细胞培养液，其编号分别为：NO.I、No.2、No.3、No.4、No.5，其中No.1为对照组，其它四个为不同的样品组。

实验步骤

1. RNA抽提

1) 样品处理：取适量样本加入 1ml TRK 裂解液匀浆样品。室温 14,000 × g 离心 5 min去除不溶解的的杂质，小心转移上清至 1.5ml 离心管。

2) 加入等倍体积 70% 乙醇至裂解液中，抽打或涡旋混匀。

3) 将柱子套在收集管中，转移混合液至柱子中。室温 10,000 × g 离心 30-60 秒，弃去滤液。

4) 把柱套放新收集管中，加入 300ul RNA Wash Buffer I 至柱子上，按以上条件离心，弃去滤液。把柱套放回收集管中。

5) DNase 消化: 配制 DNASE 消化液( Digestion Buffer, 73.5ul ; RNase-Free DNase I,1.5ul) ,混匀, 将消化液转移至柱子膜的正中央，室温静置 15 分钟。

6) 加 500ul RNA Wash Buffer I 至柱子，按以上条件离心，弃滤液。

7) 把柱套放回收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上条件离心，弃滤液。

8) 把柱套放回新收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上条件离心，弃滤液。

9) 把柱套放回收集管中， 10,000xg 离心空柱 2min 以甩干柱子基质。

10) 把柱子装在 1.5ml 离心管上，加入 30-100ul DEPC Water 柱子基质上，室温静置 2min 。10,000xg 离心 1min 洗脱出 RNA 。

11) RNA浓度测定

吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀释10倍后．在Nanodrop上测定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其OD260／OD280。

2. RNA电泳检测

1) 变性胶制备

取1gAgarose 75ml去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10ml 10×Mops和15ml 甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。

2) 电泳缓冲液配制(1×Mops)

取50ml 10×Mops。用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中添加EB。

3) RNA样品处理

取RNA 样品3u1．10×Mops 2u1．最后补充DEPC 水至20ul，65℃变性10min 后立即冷却．加入2ul 10×RNA loadingbuffer即可电泳。

4) RNA电冰

先把RNA 胶放入电泳槽中，100V 作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的RNA 样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的2／3处，取胶拍照。

3. 反转录

1)  融解反应所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，进行短暂离心后放置冰上待用。

2) RNA-Primer Mix的配制反应（所有反应液的配制都在冰上操作）在预冷的RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积13μl。

试剂组分                               体积                        终浓度

Total RNA                                                               1μg

60μM Oligo（dT）18           1μL                           2.4μM

DEPC 水                                至总体积13μl

3) RNA变性

混匀RNA-Primer Mix，进行短暂离心，65℃变性10min后立即放置冰上。

4) 配制反转录反应液

在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μl。

试剂组分                             体积                终浓度

RNA-Primer Mix                 13μl

5×RT Reaction Buffer            5μl                 1×

25mM dNTP                          1μl                  1mM

25U/μl RNase Inhibitor         1μl                  1U/μl

200U/μl M-MLV RTase        1μl                  8U/μl

DEPC水                                 4μl

总体积                                  25μl

5) 反转录反应

混匀反应Mix，短暂离心后42℃孵育1h。

6) 灭活并保存反转录产物

反应结束后，85℃灭活处理5min，最后-20℃保存反转录产物。

4. 定量PCR实验

采用染料法（SYBR Green I）进行相对定量分析，实验设计是按照ΔΔCt解析法来进行设计。实验步骤如下：

1) 将2XAllinOneTMQ—PCR Mix在室温下融解．轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心。同时在使用过程中始终保持避光。

2)  PCR reaction mix的制备 (在冰上操作)

试剂                                                用量                  终浓度

2XAllinOneTMQ—PCR Mix         10μl                   1×

ddH₂O                                              1μl

PCR Forward Primer（4μM）       2μl                     0.4μM

PCR Reverse Primer（4μM）        2μl                     0.4μM

cDNA                                               5μl

总体积                                            20μl

注意：在实验中也设计了NTC(No Template Control)，其为阴性对照，即在反应中用水来代替模板cDNA，其它试剂不变．从而来质控是否体系有污染。迅速将PCR reaction mix稍混匀，并加入8联管中。

3) 将8联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4) PCR 反应，采用了标准的三步法程序进行反应：

循环数           步骤              温度               时间          检测

1                     预变性           95℃              10min         Off

40                   变性               95℃              10sec          Off

退火               57℃              20sec              Off

延伸               72℃              15sec              On

5) 在PCR 反应后．采用以下的程序进行熔解曲线分析

温度              温度间隔      时间           检测

72℃~95℃    0.5℃             6sec/each    On

30℃                                    30sec           off