1.收菌.将菌液从试管中倒入1.5mlEP管,10000rpm/min,30s离心.离心转速不必过大时间不必过长,以免难以悬浮.必要时收两次.离心后弃上清,将残留菌液尽量扣干.
2.悬浮菌液.用200/250ul碱提Ⅰ液（确定已加入RNAse）悬浮沉淀,可在振荡器上振荡悬浮.目的是制成均一菌液.
3.蛋白质变性.加入同Ⅰ液等体积Ⅱ液,轻柔颠倒6~8次.动作一定要轻柔,以免扯断质粒.
4.中和SDS变性作用,沉淀蛋白质及基因组DNA.加入Ⅲ液,体积为Ⅰ液的1.2倍.加入后立即上下颠倒6~8次,以免局部作用.
5.除蛋白.13000rpm/min,5min离心.
6.酚氯仿抽提.将离心后上清倒入酚氯仿管中,剧烈震荡混匀,至看不出液体分层现象.（在离心过程中即可进行酚氯仿分装,400ul/管.酚氯仿有一定毒性,加入时注意将枪尖抵到EP管壁上,以免溅出腐蚀皮肤.）13000rpm/min,5min离心.
7.异丙醇沉淀DNA.将离心后上清用200ul的枪吸入异丙醇管中,共吸两次.上下颠倒6~8次.（异丙醇分装同6中酚氯仿分装操作,吸走上清的酚氯仿管也要盖上管盖扔到垃圾桶中）13000rpm/min,5min离心.
8.75%乙醇洗涤.600ul75%乙醇洗涤,将枪尖对着管口处管壁并旋转EP管进行乙醇洗涤,管口略朝下,以使乙醇立即顺势流出,注意不要将枪尖对着管底,以免冲起沉淀在底部的质粒.（此步操作需要一定技巧和熟悉度,若不便操作可选择加入500ul乙醇,13000rpm/min,2min离心,弃上清）洗涤后,将残留乙醇扣干.
9.除乙醇.在60°烘干机或抽干机上除乙醇,至靠近管口无酒精味.约5~10min.（尽量将乙醇除干净,以免影响后面的操作效率）
10.水溶.40ul超纯水溶解质粒DNA.一般也可将加入后的溶液盖上盖子在烘干机上促融2min.
11.跑胶鉴定.2ul质粒跑琼脂糖凝胶鉴定.有一条明显的条带即说明提到了.
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