SELDI蛋白质纯化鉴定

实验目标

针对血清、血浆、体液、组织、真菌、细菌、细胞培养物以及植物等样本的差异蛋白质组研究，以蛋白质芯片为载体，通过对目标疾病样本组及对照组之间进行鉴定，以期找到能够区分不同组别的差异峰，并通过对差异峰进行蛋白质鉴定找到与目标疾病密切关联的基因/蛋白。 

实施方案    

一、目标蛋白

1.利用SELDI-TOF-MS蛋白芯片系统寻找出蛋白表达谱中有意义的差异蛋白。

2.筛选符合p<0．05为统计学有显著性差异蛋白或由BPS聚类软件计算得出的诊断模型组成蛋白。

二、目标蛋白的分离纯化

1.利用白蛋白/IgG去除试剂盒去除样本中高丰度蛋白。

2.利用分子筛K30-100去除样本中的分子量大于30-100Kda的蛋白。

3.利用与先前SELDI蛋白表达谱所用的蛋白质芯片相一致的纳米磁珠吸附包含目标蛋白在内的一类蛋白（如SELDI表达谱所用WCX2芯片则选用WCX磁珠）。

4.蛋白浓缩，将吸附后的蛋白液体汇集到EP管置于冷冻干燥机冻干8小时，即得到蛋白冻干干粉。

5.蛋白定量，总蛋白量需达到50-100ug，入量不够可继续按之前步骤增加样品用量。

6.Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine -SDS-PAGE）。

三、胶内蛋白质原位酶解和质谱鉴定

1.选取考马斯亮蓝染胶上的蛋白条带，同时切下一个阳性对照点和阴性对照点（空白胶），用去离子水充分洗涤。

2.用含50％乙腈的25 mmo1碳酸氢铵溶液脱色3次，然后用乙腈吸干胶中的水分，胶粒自然挥发干燥。

3.经二硫苏糖醇（DTT）还原和碘乙酰胺（IAA）烷基化后，胶粒用乙腈脱水后自然挥发干燥；加入用25 mmo}／L碳酸氢铵溶液配成的适量胰蛋白酶溶液于各管中，室温1小时后吸出酶溶液，再加入适量 25 mmol／L碳酸氧铵溶液使胶粒保湿，37℃保温12 h。

4.吸出上清，加入5％三氟乙酸，50％乙腈溶液40℃保温1 h，重复1次，合并上清，自然挥发干燥至溶液终体积为5ml。

5.基质选用Ⅱ一氰基一13一羟基肉桂酸，饱和地溶解在30％乙腈、lO％丙酮和0.1％的三氟乙酸中，用Bruker公司肽混合物作为外标。质谱采用Bruker公司BIFLEX型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），在延迟解吸和反射模式下进行谱图的采集。

6.使用搜索引擎（http://www.matrixscience.com） Mascot在NCBI数据库中搜索，zui终确定蛋白质的相关信息。

四、目标蛋白的免疫学验证

（一）酶联免疫吸附测定（ELISA）验证鉴定出的蛋白质

1.样本处理：室温血清自然凝固10-20分钟，3000rpm离心20分钟，收集上清。

2.标准品的稀释与加样。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30被浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50ul,空白孔除外。

7.温育、洗涤同上。

8.显色：每孔先加入显色剂A50ul,再加入显色剂B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

9.终止：每孔加终止液50ul，终止反应。

10.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

（二）免疫沉淀（Immunoprecipitation）和蛋白质芯片检测

1.取同一份血清样本20ul,分成a、b两等份。

2.a份加入目标蛋白的ELISA Kit孔中，并且入40ul样品稀释液，温育30分钟。

3.30分钟后分别在a、b血清样本中加入PH=4.0的NaAc350ul和390ul，置振荡器400-600转/分, 4℃震荡1小时。

4.洗脱2次，芯片加样并读取数据。