SEM特殊样品的制备技术，你知道吗？

　　一、直接观察法

　　1.基本描述:样品不经过任何处理,直接粘贴到样品托上入镜观察

　　2.适用范围:适合于低倍条件下, 观察含水量少的、表面有一定导电能力的、对分辨率要求不高的样品.

　　3.基本步骤:取材→风洗水洗后风干或不洗→粘样→常压或低压观察

　　4.适用样品: 植物干标本,干种籽,干果、果壳,竹木、骨骼、牙齿、蛋壳、土壤、岩石、金属等

　　二、活体观察法

　　1. 基本描述：

　　利用样品本身具有的导电和产生二次电子的能力，直接观察一些体积较小、含水分不多的活体昆虫或新鲜组织、器官的方法。其特点是：可观察生物活体形态结构和生活状态，图像表现真实，没有变形或人为附加结构。

　　2. 基本要求：

　　⑴ 限制昆虫的爬行和跳跃，用胶带限制其活动。

　　⑵ 样品体积尽可能小；

　　⑶ 低压观察常用2－5Kv，最大10Kv；

　　⑷ 操作熟练，迅速观察尽早摄影

　　3. 基本步骤：

　　取材→清洗或不洗→胶带粘样→常压或低压观察

　　4. 适用样品：

　　螟、蛾、蚊、蚁、蜂、螨、线虫、被粘牢固的昆虫或其器官

　　三、粘贴镀膜观察法

　　1. 基本描述：

　　 样品只进行粘贴、镀膜即可。

　　 其特点：常压观察下获得高分辨率高放大倍数图像。

　　2. 适用范围:

　　 适宜 观察表面细微结构丰富、含水量少的、形态比较固定或不宜进行脱水或干燥的样品。本方法解决了样品的导电率及二次电子发射量的问题，可以常压下观察高倍率、高分辨率图像

　　3. 基本步骤：

　　 取材→粘样→镀碳（样品表面凹凸变化大的可先喷镀碳层）→金属膜 →常压观察

　　4. 适用样品:

　　 成熟的孢子、花粉，生活状态的菌体、菌落，尘埃、微小颗粒，丝绒、毛发，表面凹凸变化大的样品，如昆虫体表等。

　　四、熏蒸固定观察法

　　1. 基本描述：

　　粘贴后的样品放置于密闭容器中，用熏蒸法进行固定，经镀膜或不镀膜即可观察。其特点：该方法适合“不宜在液体中处理样品”，蒸汽固定剂为1％－2％的锇酸，全部操作在通风橱进行，高倍观察时还应离子溅射镀膜。

　　2. 基本步骤:

　　取材→粘样→熏蒸固定(10-30min)→镀膜或不镀膜→常压或低压观察

　　3. 适用样品: 固定培养基上的培养物，用于研究培养细胞的生长繁殖过程，菌落的自然状态、菌丝的生长，孢子的形成等。

　　五、石蜡组织切片观察法

　　1. 基本描述：

　　对动植物的石蜡切片进行适当处理，放在SEM下观察。其特点：图像分辨率高、景深大立体感强，制样简单、成本低、时间短。

　　2. 基本步骤：

　　光镜定位→切片→贴台→脱蜡(二甲苯,3-5min后滤纸吸附溶解物，反复3-5次)→镀膜(或不镀膜)→观察

　　3. 适用样品：

　　一切组织的石蜡切片都适用，但对已经封固或加盖片的不能用。

　　六、样品的割断

　　（一） 树脂割断法

　　1. 环氧树脂冷冻割断法：

　　取材修样(1＊1＊5mm) →固定脱水→包埋置换→固化→割断样品→脱树脂→临界点干燥→装台粘胶

　　2. 苯乙烯树脂割断法

　　⑴ 特点:

　　a.包埋的树脂已聚合,可长期保存

　　 b.割断时在室温下进行

　　 c.易割断较硬的组织(骨骼,结缔组织)

　　⑵ 步骤：

　　取材固定脱水→置换→包埋→聚合→割断→脱树脂→醋酸异戊酯置换→临界点干燥→装台粘胶

　　(二) 有机溶媒割断法

　　1. 无水乙醇冷冻割断法:

　　优点:制作时间短,不易弄脏容器

　　 步骤:取材固定脱水→100%乙醇包埋→冰冻固化→冷冻裂断→融化乙醇→临界点干燥→装台粘胶

　　2. 70%乙醇冷冻干燥

　　 特点:经济简单,但不能人为确定断裂面

　　步骤:准备→冷冻→自然断裂→冷冻干燥→装台→喷金

　　(三) 干燥样品的割断

　　方法:

　　 (1)刀切

　　 (2)镊子掰开

　　 (3)双面胶带法

　　 (4)液氮冷冻割断

　　七、蚀刻法

　　1. 酶蚀刻法

　　 利用酶的作用使细胞的一部分物质被蚀刻去掉, 从而清楚的显示出另外一部分结构。

　　如：利用链霉蛋白酶(prorase)处理小麦的胚乳细胞，把包在外面的细胞去掉，以观察淀粉的结构。

　　2.离子蚀刻法

　　使用离子溅射仪进行辉光放电时，用高速的阳离子冲击样品表面，剥离掉样品的成分，暴露样品内部细微结构。

　　如：用该方法可以看到白细胞、胰脏外分泌细胞的核表面结构，清楚看到核孔的分布状况。

　　八、铸型技术

　　1. 概念：

　　为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术。

　　2. 常用的铸型剂：

　　甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，是理想的铸型剂。

　　3. 用ABS制作血管铸型样品的一般步骤

　　⑴ 灌流和注入铸型剂

　　⑵ 腐蚀和清洗

　　⑶ 显微解剖和剥制铸型

　　⑷ 干燥和镀膜

　　九、环氧树脂包埋的样品SEM观察法

　　1. 基本描述：

　　环氧树脂包埋的样品切成半薄切片或超薄切片后，再将环氧树脂除去，在SEM下观察研究，可以对样品的细胞结构进行多种综合研究，得到更多的信息。

　　2.常用溶剂：

　　氢氧化钠饱和乙醇（或醚类、丙酮）容易可以溶解已经聚合的环氧树脂，将NaOH溶解于乙醇，饱和（2％－4％），放置2－3天，在此过程中产生氧自由基，溶液颜色由浅褐色变成金棕色，氧自由基可以打断环氧树脂和酸酐间的酯连接，溶解环氧树脂。也可用NaOH的冠醚溶液。

　　3.操作步骤：

　　⑴ 解剖镜下除去环氧树脂中不感兴趣的部分。

　　⑵ 将组织块（或切片）放入合适的容器中，其中加入溶解液NaOH的乙醇溶液5－10ml,1-4h

　　⑶ 样品取出放入绝对乙醇(或冠醚)中彻底清洗组织

　　⑷ 临界点干燥

　　⑸ 粘胶镀金属膜并观察。