Science报道：新研究有望解决传统CRISPR“太大”问题

　　过去6年，CRISPR从原本一个默默无闻的“细菌免疫机制”转变成生命医学领域炙手可热的“香饽饽”，让基因编辑以前所未有的精准度和便捷性完成多个突破。但是，最流行的CRISPR系统过于“庞大”，限制了其临床应用。为此，有研究团队对其进行了“删减”，研发出了“苗条”版的剪辑工具。

The Cas9 enzyme, key to the CRISPR system, has a lot of fat that it can lose and still serve as a powerful tool. MELETIOS VERRAS/SHUTTERSTOCK.COM

　　传统的CRISPR组件包括基础版酿脓链球菌Cas9酶（SpCas9）、引导RNA（gRNA）。其中，SpCas9 会在gRNA的指引下与特定DNA结合，并对其剪切。在临床应用中，许多研究团队会构建“医疗包”——将Cas9基因和其他关键组件包裹进一个无害的病毒中，从而进入体内细胞实现遗传缺陷的精准修复。

　　然而，考虑到SpCas9蛋白由1,368个氨基酸组成，体积太大不能通过病毒包装和递送。对此，科学家们希望设计出更精简版的Cas9。

　　来自伯克利加州大学的结构生物学家David Savage带领的研究团队利用了一个“定向进化”的计划设计了一个更“苗条”版的Cas9s，并于上周在冷泉港CRISPR年会上分享了最新的研究成果。

　　01、改造细则

　　他们将改造这一蛋白的方法称为：通过迭代凝胶排阻方法最小化（Minimization by Iterative Size-Exclusion Recombination，MISER）。

　　首先，这项技术使用两种酶系统化剪切SpCas9的基因序列，提取出其中编码不同蛋白结构域的部分序列。

　　随后，David Savage和团队检测这些分割开的基因序列，以验证它们是否仍然保留着Cas9结合DNA的能力。他们将有能力的片段组合起来，并添加了特异的truncated options。

　　迄今为止，他们已经获得了50万种变体。“让我们意外的是，‘缩减’后的Cas9可以忍受巨大的基因缺失，工作良好且灵活。” David Savage解释道。

　　早前韩国科学家曾在空肠弯曲杆菌中发现了小型的Cas9酶CjCas9，由984个氨基酸组成。现在，这一最新改造再次“升级”，获得的最小化的MISER Cas9突变体仅仅只包含880个氨基酸，约为原始SpCas9大小的三分之二。

　　02、突破和挑战

　　MISER突变不一定可以实现传统CRISPR-Cas9系统所能完成的一切潜能。其中一个障碍是：一些突变的Cas9s可以锁定基因组中的特定靶点，但是并不能切断DNA。

　　但是，这个功能缺陷的Cas9s同样也是一个方便的工具，可以运送其他分子到达特定的目的地。一个特别强大的CRISPR技术——“碱基编辑”（base editing）则是利用该工具将一种关键酶运送至特定碱基，随后实现单碱基的置换。

　　哈佛大学的化学家David Liu是全球率先研发出单碱基编辑技术的科学家，他认为此次David Savage团队的研究是“新方法的一个早期应用，能够促进基因编辑领域更接近于一个长期目标”。

The genome editor CRISPR cuts DNA with help from a guide RNA (green and red) and a Cas9 enzyme (outline) that latches onto a three-base sequence (yellow). KC ROEYER/UNIVERSITY OF CALIFORNIA, BERKELEY

　　03、其他“升级”版Cas9

　　CRISPR的“光环”很强大，从基因工具到临床治疗，这一技术有着巨大的潜能。然而，脱靶效应一直是该技术应用的瓶颈之一。如何降低脱靶效应？科学家们想出很多妙招。

　　2015年末，张锋团队通过改变构成化脓性链球菌Cas9酶的约1，400个氨基酸中的3个氨基酸，研发出“增强型”酿脓链球菌Cas9（eSpCas9），将“脱靶编辑”显著减少至无法检测到的水平。

　　2016年初，麻省总医院的研究团队猜测，降低Cas9酶与靶DNA之间的互相作用或许可以更加完全地消除脱靶效应。为了验证推测，他们通过替换DNA链重组Cas9酶变体，最终获得SpCas9-HF1，证实其可以显著降低脱靶效应。

　　2017年，CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna团队利用单分子FRET（(Förster resonance energy transfer）技术发现，Cas9与sgRNA形成的复合物中的REC3结构域负责感知靶向结合（target binding）的准确性，然后向REC2结构域发出信号，让其为HNH核酸酶域打开一条通路，最终激活Cas9的“剪刀作用”。通过改变REC3部分，研究团队设计出了一种改良版的、超精确的（hyper-accurate）Cas9——HypaCas9，有望克服脱靶效应。

　　2018年，David R. Liu团队带来了“升级版”的Cas9 变体——xCas9， 证实其在基因编辑时更灵活、更精确，可以靶向更多的基因位点，并减少“错误编辑”的风险。他们发现，相比于Cas9，xCas9错误编辑的概率降低了。

　　此外，科学家们还找到了靶向RNA的基因编辑酶C2c2（Cas13a）、CasRx（Cas13d）以及有任意切割单链DNA潜能的Cas12a（Cpf1）……未来，我们期待更多的基因编辑酶，给予更多的用途和潜能。