Science等两篇论文实现CRISPR多基因编辑与多重基因编辑

　　12月，首先是Braod研究院的研究人员在CRISPR–Cpf1的基础上打造了一个多重化基因编辑系统，其后，来自中科院动物所的研究人员也在CART细胞中实现多基因编辑。这两项成果分别公布在Science和Cell Research杂志上。

　　CRISPRs和CRISPR相关蛋白（Cas）蛋白的新应用，已经彻底改变了基因工程。在单引导性RNA（sgRNA）的指导下，CRISPR-Cas9系统可在任何基因组位点上产生双链断裂（DSBs）。这些DSBs可以由HR或通过非同源末端连接（NHEJ）修复。

　　第一代CRISPR技术：CRISPR-Cas9能够在引导RNA的指引下，靶标并切割入侵者的遗传物质。第二代CRISPR-Cpf1也能在crRNA的引导下在人类细胞中剪切目标DNA。

　　Braod研究院的研究人员在此基础上打造了一个多重化基因编辑系统。过去用Cas9靶标多个基因组位点需要构建多个或者很大的表达载体，使这种基因组编辑技术受到一定的局限。研究人员发现，Cpf1能够加工自己的CRISPR RNA (crRNA)。而且Cpf1介导的pre-crRNA加工是独立于DNA剪切的。这种能力可以用来简化多重基因组编辑。他们在此基础上设计CRISPR阵列，用一个载体同时在哺乳动物细胞编辑了四个基因，在小鼠大脑编辑了三个基因。

　　此外，中国科学院动物研究所王皓毅研究组利用CRISPR-Cas9技术将αβT-cell receptor (TCR)从异体的CART细胞中敲除，避免移植物抗宿主病（graft-versus-host-disease，GVHD）的发生，将人类白细胞抗原（HLA）敲除降低自身的免疫原性。

　　另外，PD-1是同肿瘤免疫逃逸相关的T细胞表面抑制因子，考虑到阻断PD-1信号通路在许多肿瘤类型中都取得了较好的疗效，研究人员同时在CART细胞中敲除了PD-1基因，来阻断PD-1信号通路。

　　制备异体CART细胞需要进行多基因同时编辑，CRISPR-Cas9这一RNA介导的DNA核酸酶系统是非常适合的技术平台。在此项研究中，利用CRISPR-Cas9系统对CART细胞进行双基因（TRAC和B2M）或者三基因（TRAC，B2M及PD-1）敲除。结果表明，这些经过基因编辑的CART细胞同普通CART细胞相比，在体外及体内具有相当或更强的肿瘤细胞杀伤功能，有望成为临床应用的效应细胞。

　　CART（Chimeric Antigen Receptor T cell）细胞治疗是非常有前景的肿瘤治疗方法，嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor，CAR）是由人工设计合成的跨膜蛋白，包括细胞外、跨细胞膜以及细胞内三个部分。CAR的细胞外部分主要是识别特定抗原的单克隆抗体可变区（scFV），负责识别特异性抗原。跨膜区确保CAR可以在细胞膜上定位，而细胞内区域则负责激活T细胞，产生T细胞介导的免疫反应。临床数据表明，CART在B细胞恶性肿瘤治疗中取得了很好的疗效。

　　但是，目前采用的方法都是自体过继细胞治疗（autologous adoptive cell transfer，ACT），这种方法昂贵并且耗时。对于新生儿及老年患者，很难获得足量且状态良好的淋巴细胞用于CART细胞治疗。因此目前CART细胞治疗的一个重要研究方向是怎样使用一个健康献血者的T细胞制备大量的CART细胞，满足数百名患者的临床使用。这一技术的建立将极大降低CART疗法的成本，可以更好地保证统一制备的细胞质量，而且患者在需要时可以马上得到CART细胞进行治疗。