Southern印迹及基因组DNA杂交技术实验

基因组 DNA

限制性缓冲液

琼脂糖凝胶

1. 7~20 μg 基因组 DNA 稀释到 500 μl 合适的限制性缓冲液中。4℃ 过夜。

2. 每管加 10~20 单位限制性酶。孵育 4~6 小时。10 μl 消化液在小琼脂糖凝胶上电泳检测消化的程度。如果需要，就在消化液中补加酶。

3. 用乙醇沉淀消化物：加 50 μl 3 mol/L NaOAc，混匀。然后加 1 ml 100 % 乙醇并混匀，在 -20℃ 至少放 30 分钟；或在干冰中放 10 分钟。离心 20 分钟（在离心机中定好管子的方向，这样你知道沉淀的位置）。去掉上清。

4. 用 70% 乙醇洗一次：加 1 ml 70% 乙醇，离心 5 分钟。去掉上清。离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体。在空气中干燥 15 分钟。同时着手进行步骤 5.

5. 0.7% 用 TAE 作为缓冲液的琼脂糖凝胶。凝胶中含溴化乙锭以避免在后面进行凝胶染色。





6. 用 TE ( pH 8 ) 重悬沉淀物。

7. 慢慢地跑凝胶电泳；跑过夜或跑一整天（2.5 v/cm 凝胶长度可以允许凝胶跑过夜）。循环电泳缓冲液以避免形成 pH 梯度（缓冲液应该从阴极流到阳极）。

8. 没有溴化乙锭的凝胶要染色 15 分钟（在 1 L 用过的 TAE 缓冲液中加 15 μl 10 mg/mI 溴化乙锭）。拍照以保存凝胶记录。

9. 准备把凝胶转移到固相支持物上。

(1) 传统方法

① 凝胶在 4~5 倍凝胶体积的 0.25 mol/L HCl 中孵育 15 分钟去嘌呤。

② 换 3 次变性溶液洗凝胶（每次用 3~4 倍凝胶体积），洗 1 小时以上。

变性溶液（配 3 L）：

0.5 mol/L NaOH          60 g NaOH

1.5 mol/L NaCl            261 g NaCl

使用新鲜制备的溶液。

③ 换 3 次中和溶液中和（每次用 3~4 倍凝胶体积）1 小时以上。

中和溶液（配 3 L)：

1 mol/L Tris                363 g Trizme 碱

2 mol/L NaCl              350 g NaCl

                                 用 HCl 调 pH 到 6.5，约 100 ml

贮存在室温。

④ 在 20 x SSC 溶液中进行转移。

20x SSC 溶液（配 1 L)：

3 mol/L NaCl              175.3 g NaCl

0.3 mol/L 柠檬酸钠      88.2 g 柠檬酸二氢钠

                                 pH 调到 7.0

贮存在室温。

(2) 碱转移法：只可以使用带正电荷的尼龙膜，用该方法硝酸纤维素会碎掉。

① 在 4~5 倍凝胶体积的 0.25 mol/L HCl 中孵育 15 分钟使凝胶去嘌呤。

② 组装毛细转移装置，20 x SSC 溶液换成 0.4 mol/L NaOH。

③ 在 0.4 mol/L NaOH（16 g/L）中进行转移。

10. 按图所述组装毛细转移装置。



(1) 在组装转移装置前，把膜、滤纸和纸巾切成适当的大小。进行毛细转移时，液体必需在被纸巾堆吸收前通过膜。如果纸巾或滤纸接触到凝胶或滤纸条，就会发生“短路'这种情况。这种情况可以通过依次缩小膜、滤纸和纸巾的大小来避免。给出的尺寸是用于 20 cm x 20 cm 的凝胶。对于不同大小的凝胶要调整尺寸。



(2) 在 20 X SSC 溶液里打湿滤纸条（26 x 35 cm 滤纸）并把它铺在一块玻璃平板上使两端挂在盛有 1 L 20X SSC 溶液的平皿中。用一根玻璃吸管作为擀面杖，去掉任何玻璃和纸之间的空气泡。

(3) 把凝胶放在滤纸条上。

(4) 先在水中然后在 20 x SSC 溶液中把膜打湿，并把膜放到凝胶上面。用吸管代替擀面杖去掉任何空气泡。

(5) 在 20 x SSC 溶液中打湿滤纸（18.5 x 18.5 cm )，放在膜上，确定要放在中间。用吸管作擀面杖去掉空气泡。

(6) 把 1 堆纸巾放在滤纸上（中间）。

(7) 盖一块玻璃或塑料板（如用干倒胶的托盘）并在上面压重物（例如一个放满液体的 500 ml 瓶子）。

11. 至少进行 16 小时的转移。在拆除转移装置前，在孔的位置做上标记。

12. 如果你使用的是传统方法，就用例如 Stratalinker 牌的紫外交联仪把 DNA 交联到膜上。如果你使用的是碱转移法，就不要作交联。

13. 在 2x SSC溶液中洗膜。几分钟后，用你的手指（戴干净手套）轻轻地摩擦表面去掉所有黏附在滤膜上的琼脂糖。在杂交分析中，黏附在膜上的琼脂糖会造成很大的背景。

14. 用水洗膜并把它保存在干净的纸巾之间，直至准备进行杂交分析操作。

在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题：转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。若用到有毒物质，必需注意环保及安全。

分子杂交是基因探测的基础，除了用印迹杂交外，还有斑点杂交法。即将DNA样品变性后直接点在硝酸纤维滤膜上，再与探针杂交，或者将细胞或病毒点在膜上，菌落或菌斑原位地吸附在膜上，经过变性处理，再进行杂交。斑点杂交多用于病原体基因，如微生物的基因，但也可用于检查人类基因组中的DNA序列。

本实验来源《细胞实验指南》 黄培堂 等译。