Southern杂交技术2

三：操作

(一)转膜

1电泳

2切胶 在紫外下，切取凝胶有条带部分

3脱嘌啉0.25NHCL浸泡凝胶10分钟，蒸馏水洗胶（大于15kb的DNA片段转移时做此步骤）

4变性，变性液（0.5MNaOH、1.5MNaCL）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶

5中和,中和液（0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCL）浸泡凝胶2次，每次15分钟，蒸馏水洗胶

6平衡，凝胶在20×SSC中室温平衡10分钟

7转膜,取一塑料盒,将一干净玻璃板横架于盒上，盒中倒入10×SSC，作为转移缓冲液，将2张大小合适的滤纸用20×SSC溶液浸湿，放置于玻璃板上，作为滤纸桥

将处理好的凝胶切去多余部分并切下一角作标记，胶面反转放置于滤纸桥上，四周用Parafilm膜封闭，以防短路

剪取一块面积稍大于凝胶的硝酸纤维素膜（NC膜），以2×SSC溶液浸湿后置于凝胶上

剪取2块相应大小的滤纸，以2×SSC溶液浸湿后置于NC膜上

（滤纸、凝胶、NC膜、滤纸间都不能有气泡）

滤纸上面放一叠吸水纸，上面压一块玻璃板，再压上500g左右的重物，转移过夜

8烤膜，转移结束后，NC膜在与凝胶切角相对处，用铅笔做记号，用6×SSC溶液室温漂洗5分钟，以充分洗去沾上的凝胶成分，吸水纸吸干残余液体，室温晾干，NC膜用滤纸夹裹好，80℃烤膜2小时

9烤干的NC膜用２×SSC浸润。

注：

1：在７操作中每层间应确保无汽泡存在。

2：操作中吸水纸的大小应小于顶层滤纸，且不能于滤纸下的任何一层接触。

3：烤片的作用在于使已转移条带更牢地结合于NC膜上。

（二）杂交

1封闭，将杂交好的NC膜用滤纸吸干，放入一新杂交袋中，用封闭液４２℃封闭２－４小时（封闭液用量为４ml/50cm2膜）。

2预杂交，将上部浸润的NC膜装入杂交袋，加入预杂交液（0.2ml/cm2膜），使膜与预杂交液充分混匀，赶走汽泡，封口。65℃２－４小时。

3杂交，倾出预杂交液，加入杂交液（预杂交液＋临用前变性的标记好探针，终浓度为1-2ng/ml）（0.2ml/cm2膜），65℃过夜。

4洗膜，用洗涤液Ａ，Ｂ分别洗膜两次，每次洗膜液体积不少于250ml。

5反应，弃去封闭液，加入亲和素－碱性磷酸酶溶液，室温避光反应１５分钟，轻轻震荡。取出膜，用洗涤液Ｃ，Ｄ分别洗涤三次，每次洗涤体积不应少于300ml，每次5分钟，振荡。

6显色，将膜转入新袋中，加入底物溶液（用量为４ml/50cm2膜）。封袋，避光放置，显色数分钟至数小时，以杂交带清晰，背景低为好。

十五－2:DIG试剂盒杂交实验

一仪器：同十五－1

二试剂： 变性液：0.5MNaOH、1.5MnaCL

中和液：0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCL

20×SSC溶液（同十七－1）

预杂交液：Blocking溶液（试剂盒带）

杂交液（含5-25ng/ml，DIG标记探针的预杂交液）

low stringence buffer(2×SSC，0.1%SDS)

high stringence buffer(0.5×SSC，0.1%SDS)

洗涤液（0.1M马来酸，0.15MNaCL,pH7.5,0.3%Tween-20,）

抗体溶液（含1/5000的DIG标记碱磷酶的Blocking溶液）

平衡液（0.1MTris-HCL,0.1MNaCL pH 9.5）

显色液（平衡液中含2％BCIP/NBT储存液）

BCIP/NBT储存液(试剂盒带)

三：操作

(一)转膜 同十五－1

（二）杂交

1预杂交，将烤好的NC膜放入一个比膜稍大的塑料袋中，按100cm2/10ml的比例加入适量的预杂交液，赶走气泡，封口机封口，42℃预杂交30分钟

2杂交，倒掉预杂交液，按100cm2/10ml加入杂交液，42℃杂交过夜

（三）检测

1准备好一个塑料盒，放入100mllow stringence buffer，将杂交后的NC膜取出，置于上述溶液中，室温晃动5分钟

2取新鲜的low stringence buffer,重复上述操作一次

3将NC膜取出，置于65℃预热的100ml high stringence buffer,65℃晃动15分钟

4取新鲜的high stringence buffer,重复操作一次

5将NC膜转移至塑料盒中，内含洗涤液，室温晃动2分钟，倒掉洗涤液。

6加入100mlBlocking溶液，室温晃动30分钟，以除去没有特异结合的探针，倒掉Blocking溶液

7加入20ml抗体溶液，室温晃动30分钟，倒掉溶液

8用洗涤液室温晃动洗涤2次，每次15分钟，以除去多余的抗体，倒掉洗涤液

9平衡，加入20ml平衡液，室温放置3分钟，倒掉平衡液
10显色，加入10ml显色液，显色，目标条带显色后用50mlTE终止反应。