TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)是检测细胞凋亡的经典方法。本试剂盒采用TUNEL法，应用高活性的基因重组末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡细胞断裂的DNA 3’-羟基（3’-OH）末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷（FITC-12-dUTP），通过检测FITC-12-dUTP标记的DNA片段来检测细胞凋亡。FITC-12-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察，也可用流式细胞仪检测。本试剂盒已经多次优化，FITC-12-dUTP标记和未标记dNTP处于最佳搭配比例，这样在进行3’-OH末端核苷酸掺入时，同一个断裂的DNA片段末端可以有更多的FITC-12-dUTP掺入，从而大大提高了检测的灵敏度，减少了背景反应。再加上我们高活性的TdT酶，使得本试剂盒的检测信噪比大大提升，而背景非常干净。

TUNEL FITC末端荧光标记凋亡检测试剂盒的特点：

标记dNTP与未标记dNTP的比例经多次优化，高信噪比，高灵敏度；
TdT酶为基因工程重组产品，活性高，荧光掺入效率高，背景低；
适用于涂片、爬片、石蜡切片和冰冻切片。
试剂盒装        ~                                                                                                    

产品组成

方法步骤:  

样品预处理方案

• 石蜡包埋组织切片

• 室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再浸泡5分钟以彻底脱掉石蜡；

• 用100%乙醇浸泡5分钟，更换新的100%乙醇再浸泡5分钟；

• 注意：为得到最好的结果，蛋白酶K孵育时间可能需要优化。

组织冰冻切片

• 将破片浸没在4%多聚甲应溶液(溶于PBS)中，室温孵育15分钟；

• 去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体；

• 将玻片浸没在PBS溶液中，室温孵育15分钟；

• 去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。用石蜡笔或指甲油在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

• 用PBS稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为 20µg/ml；

• 每个样本上滴加100µl稀释的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育10分钟；

• 在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

• 去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

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细胞片

• 固定细胞，将细胞片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置 25分钟；

• 洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5分钟。重复用PBS洗一次；

• 轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用石蜡笔或指甲油在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在混盒中保榜样本的湿润；

• 用PBS稀释2 mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度 为20µg/ml，每个样本需要100µl蛋白酶K溶液；

• 每个样本上滴加100µl稀释的蛋白酶 K溶液，使其被全部覆盖，室温孵 育5分钟(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton® X -100溶液中，室温孵育5分钟进行通透处理)；

• 在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

• 轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

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标记及检测

用去离子水将5×Equilibration Buffer稀释成1×Equilibration Buffer。

滴加100ul  1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30分钟。同时，在冰上解冻FITC-12-dUTP Labeling Mix，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验和阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。对于面积小于5cm2的一个标准反应，其体积是50µl，用50µl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。

3)在平衡后的区域周围用吸水纸吸掉多余的 Equilibration Buffer，不要让组织或细胞发干， 然后在组织或细胞上加50ulTdT孵育缓冲液。

4)把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾，将载玻片置于湿盒内，再将湿盒用铝箔纸包裹以避免光照, 37℃孵育60分钟。

表1.准备用于实验和阳性对照反应的TdT孵育缓冲液     

• 组    分	体    积 （µl/50µl体系）	样本数目 （实验+阳性对照数）	总体积 （µl）
  dd H2O	34
  5×Equilibration Buffer	10
  FITC-12-dUTP Labeling Mix	5
  Recombinant TdT Enzyme	1

  5)  移除盖玻片，并将切片置于PBS溶液中室温孵育5分钟。

   

• 6)  轻轻去掉多余液体，换用新鲜的PBS溶液室温孵育5分钟。重复该步骤1次。

   

• 7)  用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。

   

• 注意：为了降低背景，可以尝试载玻片在步骤5用PBS洗一遍之后，再用含0.1% Triton® X-1 00和5mg/ml BSA的PBS洗三次（取代步骤6），每次5分钟，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。

   

• 8)  将载玻片浸入装有PI溶液的染色缸，暗室室温放置5分钟，此 处PI溶液是用PBS新配稀释到1µg/ml的。

   

  9)  洗涤样本，将载玻片浸入去离子水中，室温放置5分钟，共洗三次。 

   

  10)  将载玻片上多余的水吸干，但组织或细胞保持湿润。 

   

• 11)  立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在520 ± 20 nm的荧光下观察绿 色荧光。在>620 nm下观察PI的红色荧光。如有必要，载玻片可在4℃ 黑暗条件下存放过夜。

   

• 3. 阳性对照制备：如有必要，可按下述制备阳性对照。

•     1) 在样本预处理之后，加100ul DNA酶I缓冲液到固定的细胞上，室温孵育5分钟；

  2) 轻去液体，加入100µl含5.5-10units/ml DNA酶I的缓冲液，室温孵育10分钟；

  3) 轻叩载玻片去掉多余的液体，并将载玻片在装有去离子水的染色缸中彻底洗3-4次。

• 注意：阳性对照载波片必须使用单独的染色缸。否则来自阳性对照载玻片上残余的DNA酶I活性可能会在实验载玻片上引入高的背景。

• Limited Use Label License

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用梯度乙醇（90、80、70%）将切片各浸洗一次，每次3分钟，逐渐增加水分；

用PBS轻轻润洗切片，并用滤纸吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

用PBS稀释2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其终浓度为20µg/ml；

每个样本上滴加100µl稀释后的蛋白酶K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20分钟；

用PBS溶液润洗样品。轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。