Talanta：高灵敏和防污染的“准共聚焦”微液滴数字PCR阅读仪

　　清华大学医学院生物医学工程系郭永实验室在《分析学家》（Analyst）在线以封底（back cover）发表题为《一种双荧光四分类微液滴数字PCR数据的准确、可靠和自动分类方法——密度分水岭算法》（A density-watershed algorithm (DWA) method for robust， accurate and automatic classification of dual-fluorescence and four-cluster droplet digital PCR data）的研究论文，该研究将微液滴数字PCR的数据密度分布与分水岭算法（一种图像分割方法）有机结合，建立了一种微液滴数字PCR数据非监督分类的新方法。

　　微液滴数字PCR是一种单分子水平的核酸定量分析技术。通过将PCR反应体系分割为大量的微液滴，绝大多数微液滴内仅含有0个或1个模板分子，含有模板分子的微液滴在PCR扩增后呈现出较强的荧光信号。通过微液滴内荧光的检测，可以得到微液滴数字PCR数据。依据荧光强度对该数据进行分类，即可判断出含有模板分子的微液滴的数量和比例，最终通过泊松分布统计学计算，得到模板分子的绝对拷贝数。在上述过程中，微液滴数字PCR数据的分类是关键步骤，它直接影响到统计学计算的输入，因而决定着微液滴数字PCR定量结果的准确性。目前，微液滴数字PCR的数据分类方法主要有两种：一种是针对每种反应定制的监督分类算法，这些算法具有较高的准确性，但是针对不同的样本类型和检测指标，需要开发多种不同的分类算法；另一种是通用的非监督分类算法，但是它们的准确性和可靠性都不尽如人意，且时常会出现假阴性和假阳性的检测结果。

　　为了解决上述不足，研究人员模拟人眼对微液滴数字PCR数据的分类过程，将微液滴数字PCR数据作为一幅图像，提出了一种新型的数据分类方法——密度分水岭算法。该方法通过数据密度分布的判断，使用分水岭算法自动地、非监督地将网格化（图像化）的微液滴数字PCR数据沿着数据相对稀疏的位置分割为若干区域，最后通过这些区域的边界实现准确、可靠、自动的非监督数据分类（图1）。研究人员将密度分水岭算法与现有主流商业化算法进行了比较，在人类表皮生长因子受体（EGFR）的L858R和T790M突变位点的检测方面，密度分水岭算法实现的检测限是现有主流商业化算法的1/40，显着地提高了微液滴数字PCR自动化检验的检测能力。研究人员进一步使用Bio-Rad QX200和新羿TD-1两种微液滴数字PCR系统，在254例冰冻组织、石蜡包埋组织和外周血临床样本上验证了密度分水岭算法，其中绝大部分（>84%）临床样本的定量结果优于现有主流商业化算法，且全部临床样本未出现假阴性和假阳性的检测结果。

　　该研究为微液滴数字PCR的临床应用提供了一种新的自动化数据分析思路，有望用于临床的全自动核酸绝对定量。随着精准医疗的发展，开发准确、可靠、全自动的单拷贝核酸定量分析方法对于疾病的筛查、诊断、用药指导、病情监测和预后均具有重要意义。