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  清华大学医学院生物医学工程系郭永实验室在《分析学家》(Analyst)在线以封底(back cover)发表题为《一种双荧光四分类微液滴数字PCR数据的准确、可靠和自动分类方法——密度分水岭算法》(A density-watershed algorithm (DWA) method for robust, accurate and automatic classification of dual-fluorescence and four-cluster droplet digital PCR data)的研究论文,该研究将微液滴数字PCR的数据密度分布与分水岭算法(一种图像分割方法)有机结合,建立了一种微液滴数字PCR数据非监督分类的新方法。

  微液滴数字PCR是一种单分子水平的核酸定量分析技术。通过将PCR反应体系分割为大量的微液滴,绝大多数微液滴内仅含有0个或1个模板分子,含有模板分子的微液滴在PCR扩增后呈现出较强的荧光信号。通过微液滴内荧光的检测,可以得到微液滴数字PCR数据。依据荧光强度对该数据进行分类,即可判断出含有模板分子的微液滴的数量和比例,最终通过泊松分布统计学计算,得到模板分子的绝对拷贝数。在上述过程中,微液滴数字PCR数据的分类是关键步骤,它直接影响到统计学计算的输入,因而决定着微液滴数字PCR定量结果的准确性。目前,微液滴数字PCR的数据分类方法主要有两种:一种是针对每种反应定制的监督分类算法,这些算法具有较高的准确性,但是针对不同的样本类型和检测指标,需要开发多种不同的分类算法;另一种是通用的非监督分类算法,但是它们的准确性和可靠性都不尽如人意,且时常会出现假阴性和假阳性的检测结果。

  为了解决上述不足,研究人员模拟人眼对微液滴数字PCR数据的分类过程,将微液滴数字PCR数据作为一幅图像,提出了一种新型的数据分类方法——密度分水岭算法。该方法通过数据密度分布的判断,使用分水岭算法自动地、非监督地将网格化(图像化)的微液滴数字PCR数据沿着数据相对稀疏的位置分割为若干区域,最后通过这些区域的边界实现准确、可靠、自动的非监督数据分类(图1)。研究人员将密度分水岭算法与现有主流商业化算法进行了比较,在人类表皮生长因子受体(EGFR)的L858R和T790M突变位点的检测方面,密度分水岭算法实现的检测限是现有主流商业化算法的1/40,显着地提高了微液滴数字PCR自动化检验的检测能力。研究人员进一步使用Bio-Rad QX200和新羿TD-1两种微液滴数字PCR系统,在254例冰冻组织、石蜡包埋组织和外周血临床样本上验证了密度分水岭算法,其中绝大部分(>84%)临床样本的定量结果优于现有主流商业化算法,且全部临床样本未出现假阴性和假阳性的检测结果。

  该研究为微液滴数字PCR的临床应用提供了一种新的自动化数据分析思路,有望用于临床的全自动核酸绝对定量。随着精准医疗的发展,开发准确、可靠、全自动的单拷贝核酸定量分析方法对于疾病的筛查、诊断、用药指导、病情监测和预后均具有重要意义。


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