Western印迹法检测蛋白

实验概要

Western印迹法检测蛋白的敏感性约为1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板的一个孔可上总蛋白量约为100μg，所以只要被检蛋白不低于总蛋白量的万分之一，即可被检测出来。如果所分析的样品为未知时，应同时作阳性对照。杂交技术主要有NC膜的封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗与二抗的反应，显色等几部分构成。

实验原理

该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有特异性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫特异性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白－一抗－二抗的位置即将呈现一定的颜色。

主要试剂

封闭液（TBST，3％BSA）

漂洗液 TBST（10mMTris-HCL，pH8.0，0.15mMNaCL，0.05%Tween-20），PBS(0.8%NaCl，0.02%KCl，0.144%Na₂HPO₄ 0.024%KH₂PO₄ pH至7.4)

辣根过氧化物酶显色液(可用Ⅰ或II)

Ⅰ 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml  100mM Tris-HCl(pH7.6)中，加入1ml 0.3%(w/v)的NiCl₂或CoCl₂。过虑去除沉淀。取10ul  30%双氧水与上液充分混匀

注意，此液必须新鲜配制。

II  取20mg，4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中，另取60μl30%双氧水，混匀。

注意，此液必须新鲜配制。

碱性磷酸酶显色液

    5％NBT溶液 （溶于70％二甲基甲酰胺中）  66ul

    5％BCIP溶液（溶于100％二甲基甲酰胺中）  33ul

碱性磷酸酶缓冲液 100mMNaCl  5mMMgCl2  100mMTris-HCl(pH 9.5)

以上三者充分混匀，需要在30分钟内使用完。

主要设备

塑料封口机  摇床

实验步骤

1. NC膜漂洗，NC膜用TBST缓冲液漂洗一次

2. NC膜的封闭

NC膜与蛋白质的结合无任何特异性，因此作为特异性检测靶蛋白的探针－一抗蛋白也能与NC膜结合，而一旦这种结合情况发生，当加入二抗后，背景上将出现许多非特异性条带，而则势必造成目标蛋白的不可检测性。因此Western印迹技术的敏感性、可行性将取决于能否对NC膜上一些蛋白质潜在结合位点进行有效封闭。在实际操作中这些结合位点一般用脱脂奶粉封闭，也可用血清白蛋白封闭。如果操作中加蛋白封闭后，非特异性背景仍很大的话，则可在封闭液中加入Tween20，Tween20的存在，能降低背景噪声，且不影响抗体与靶抗原的结合。

将Ａ中经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液（液面需盖过胶面）室温下轻轻遥荡2-3小时。

2. 目标靶蛋白与第一抗体的反应  

一抗的稀释：将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定，但可参考下列数据：多克隆抗体，1:100-1:5000  培养的杂交瘤细胞上清液，1:100  鼠腹水细胞1:1000-1:10000

3. 将Ｂ中封闭好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量为0.1ml一抗/cm²

NC膜，赶尽塑料袋内所有气泡，封口机封口，４℃下轻轻震荡２小时。

注意，在室温下，延长反应时间，可增加靶蛋白的可检出量，但也会增加非特异性结合，加大背景噪声。

4. 洗膜。反应完毕后，将塑料袋剪开，弃去反应液，用PBS洗三次，每次10分钟。

5. 靶蛋白－一抗复合物与二抗反应

   1) 将膜从PBS溶液中转至TBST溶液中，室温下轻轻震荡１０分钟。

此操作是为了去除NC膜上的磷酸及叠氮钠

   2) 将二抗用二抗稀释液稀释，稀释度一般为1:200-1:2000。

   3) 将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0，1ml二抗溶液/cm²膜，封好塑料袋，在室温下轻轻震荡１小时。

6. 剪开塑料袋，取出NC膜，在TBST溶液中冲洗1-5次，每次１０分钟。

7. 显色 

   1) AP系统

      a. 将膜放入碱性磷酸酶显色液（10ml碱性磷酸酶缓冲液，66ulNBT，33ulBCIP）中，室温下轻轻摇动。

      b. 待条带出现后（约显色20分钟），将膜放入200ul0.5MEDTA(pH8.0)和50mlPBS溶液中

      c. 照相

   2) 辣根过氧化物酶系统

      a. 将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动。

      b. 待条带出现后（约显色1－3分钟），立刻用水洗膜，然后转入PBS中

注意，此显色带在阳光下几小时即褪色

      c. 照相