WesternBlot实验操作进阶技巧（一）

　　除非是Western blot实验方面的高手，要不就像在我看来，Western blot发展至今好像与其1979年刚被发明出来的时候一样一样，同样也是根据蛋白不同的大小（或电荷）进行电泳分离，然后转膜，利用抗体筛选出目标蛋白。

　　多年来这种技术已经成为了蛋白研究方面的一种主要技术，研究人员可以利用Western blot定性，甚至半定量的识别组织和培养细胞中的蛋白，这种操作实验可以说每天都会在实验室里上演，但同时，Western blot等blot技术也是各种审议的主题，学术造假，以及一些研究成果被退回的原因。

　　近年来Western blot技术也有了一些发展，一些新的试剂和仪器令Western更为敏感，一些主要步骤（电源，转膜等）也更为精简，虽然许多研究人员仍然使用的是化学发光法检测法和X光胶片，但一些新的技术，如数字荧光成像技术已经提高了这种工具的敏感性和可靠性，令其进入了“定量时代”。一些新的技术方法也能令Western blot可以用于单细胞检测，或者对有限及珍贵的样品进行检测，其中的一些步骤也实现的自动化。

　　减少样品量

　　过去几年里，研究人员已经迈出了检测单个细胞中DNA 和 RNA的重要一步，相比之下，蛋白检测已经落在后面。蛋白抗体质量不过关是主要的原因，这限制了研究人员在使用流式细胞仪和免疫细胞化学方法进行单细胞蛋白水平检测的精确度。而且Western blot实验需要分离得到蛋白，然而迄今为止这在单细胞中还无法做到。

　　来自加州大学伯克利分校的生物工程研究组Amy Herr等人研发出了一种新型的微流控设备：scWestern （即single-cell Western），这种设备可以帮助研究人员在四小时内完成大约2000 个体细胞的Western实验。

　　从结构上来说，scWestern 包被有30-μm厚的光敏聚丙烯酰胺（PA）凝胶，而芯片上共有6720个微孔。这些微孔的直径为20 μm，是在聚丙烯酰胺凝胶聚合时形成的。

　　从设计原理上来说，scWestern实现了高度平行的分析，而不需要单独获取每个细胞。通过被动重力驱动的细胞设置，细胞悬液接种到微孔中，每个微孔在5-10分钟内捕获0-4个细胞。而且研究人员通过优化短分离距离的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），实现了高密度的scWestern芯片。在细胞裂解后电泳开始，他们在浸没的scWestern玻片上应用电场，电泳蛋白穿过微孔壁，进入薄的凝胶层。其次这一设备利用了反应（蛋白质固定）和运输（抗体杂交）的小特征长度。在PAGE之后，蛋白质与PA凝胶交联。之后进行抗体杂交和检测。

　　研究人员应用这种方法来研究体外刺激下的干细胞信号和分化反应，结果发现scWestern能定量每个单细胞中最多11种目标蛋白，在与FACS整合时，支持稀有或珍贵细胞（~200个）的分析。

　　如何入门：

　　虽然这项技术是全新的，但是一般来说通过多次练习，刚毕业的学生在一个月内就能掌握这种技术，Herr说。

　　同时Herr也与Zephyrus Bioscience公司合作，计划于明年推出相关的自动化设备。

　　注意事项：

　　不过需要注意的是这种技术有两个限制。其一是细胞裂解后，蛋白会从微孔中漏出，造成高达40%的损失。其次是分离度欠佳，研究人员无法区分质量相差至少一半的蛋白。Herr研究组目前正努力解决这两个问题，“我想我们已经有了一些令人高兴的结果，”她说。

　　微western芯片分析技术（Microwestern，生物通注），比如Herr的“μWesterns”（scWestern之前的一个成果，比scWestern孔径大）则能帮助那些进行细胞群体研究，而不是单细胞研究的研究人员，这种方法是在一个96孔板上将细胞裂解液放到96个微小的凝胶块中，具体过程可以通过YouTube视频来看（www.igsb.org/services/mwac-methodology）。微western芯片分析能区分质量相差75kD的蛋白（蛋白质量超过200kD），同样也需要piezoelectric dispenser，而这并不便宜。

　　费用：

　　相关仪器的价格待定，如果你需要制造自己的 scWestern，那么就需要花费几千美元（其它材料准备充分），而微western芯片的价格则为每次1,800美元（当地价格）——96个抗体检测六种细胞裂解液。