WesternBlot相关技术操作与原理1

【实验原理】： Western Blot 印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通

过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经X 光片曝光、 显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。

Western blot 实验分为三个部分：

1． 样品蛋白质的制备、 蛋白质含量测定 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3． 凝胶转膜及其检测

以提取细胞蛋白为例Western 印记杂交实验流程图：

提取细胞总蛋白、测定含量

↓

制备SDS-PAGE 胶

↓

蛋白样品变性、电泳

↓

电泳转膜

↓

封闭

↓

一抗

↓

TBST 洗涤

↓

HRP 标记的二抗

↓

TBST 洗涤

↓

ECL 试剂作用

↓

X-光片曝光、显影

↓

结果分析

细胞总蛋白的提取及含量测定

一、细胞总蛋白的提取

    提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很

多。其目的都是要获取高丰度、高品质的蛋白质,以满足实验需要。

    在提取蛋白质实验中要特别考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度以及二价阳

离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白

酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的种类很多，如PMSF(苯甲基磺酰氟)；金属蛋白酶抑制剂乙二胺

四乙酸（EDTA）、乙二醇双四乙酸（EGTA）；肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽（leupeptin）、胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A）、抑蛋白酶肽（aprotinin）；甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、

甲苯磺酰丙氨酰氯甲酮（TPCK）等，要根据具体情况具体选择。

        制备蛋白质样品应遵循下述原则：

    1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。

    2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋

白酶的降解。

    3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。切勿反复冻融已制备好的样品。

（一）试剂

    1．细胞总蛋白裂解缓冲液：

     蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提,)

    2．PMSF 储存液(100mmol/L)： 称取PMSF 17.4mg，溶于1ml 异丙醇，分装后储存于

-20℃。

注意:

PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定，故应在临用前再加入到细胞裂解缓冲

液中， 使其终浓度为0.174mg/ml，如：1 ml 细胞裂解液中，加入10ul PMSF 储存液.

（二） 仪器和耗材 冷冻离心机

无菌的Tip 头、1.5ml 及0.5ml 离心管 ，

（三） 实验材料 Hela 细胞

（四） 实验步骤

1．细胞的预处理：

由37℃ CO2 培养箱中取出于60mm 细胞培养皿中培养的Hela 细胞，（细胞数约为5

×106 ），吸弃原培养液，用4℃预冷的1×PBS 洗细胞表面3～4次，以去除培养基中的血清

及死细胞，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。将洗涤后细胞直接冻存于-80℃冰箱，待

提取蛋白质。此方法可保存细胞至少两周。（注：如果需要，当用PBS 洗涤细胞后，不必-80℃冰箱冻存，可直接进行步骤2）

2．（由-80℃冰箱中取出细胞培养皿，将其置于冰上，） 向上述各培养皿中加100ul 含

PMSF 的蛋白提取液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。

3．冰浴40 分钟（通常冰浴时间为30～60 min），期间晃动3-4 次培养皿，使其作用均

匀。

4．用Tip 头集中蛋白提取液，将其收集入冰上预冷的1.5ml Ep 管中，4℃离心，12,000g

× 20min。

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