cDNA合成实验

试剂、试剂盒 二硫苏糖醇dNTP随机引物来自方案 4 的 RNA 样品 RNasin反转录缓冲液

仪器、耗材 PCR 管子 热循环仪

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

0.1mol/L 二硫苏糖醇

dNTP(每种 2.5 mmol/L)

随机引物（20~40U/ml)(1034731，RocheAppliedScience，Indianapolis，IN)

来自方案 4 的 RNA 样品

RNasin(Promega)

5X 反转录缓冲液

主要反应组分混合物（X 样品管数）

5X 反转录缓冲液                        10ul

dNTP(2.5 mmol)                          5ul

0.lmol/L 二硫苏糖醇                    4ul

随机引物                                     4ul

RNasin                                        1ul

Superscript0(18064-014,Invitrogen,Carlsbad*CA)试剂储存于-20°C

2. 特殊设备

PCR 管子，0.2 ml

热循环仪（比如，AppliedBiosystems7700sequencedetector;PEAppliedBiosystems，FosterCity,CA)

二、方法

1. 每管加入 24ul 反应混合物。

2. 加入 25ul 方案 4 得到的 RNA。

3.70°C 变性 5 min，冰浴 5 min。

4. 加入 lulSuperscriptII(最终反应体积 50ul)。

5.37°C、60 min 孵育，90°C 变性 5 min，冰浴 5 min。

6. 使用前，cDNA 样品应当储存于-20°C。