大脑发育过程中神经干细胞不对称细胞分裂的机制

　　人类大脑发育是一个复杂但是在时空上非常有序的精确组装过程。神经生物学家们近百年来一直致力于弄清楚体内调控大脑及神经系统发育的细胞分子机制。目前已经发现神经干细胞的不对称细胞分裂（Asymmetric cell division，ACD）是大脑发育过程中神经干细胞增殖和分化的重要方式。神经干细胞通过ACD，一个母细胞分裂形成两个不同的子细胞，其中一个子细胞继承母细胞的干细胞特性，将在发育过程中继续不断分裂产生新细胞，而另一个子细胞则将分化成特异神经元，不再具备增殖活性。动物神经系统发育和完善正是通过此过程来一方面不断生成新的神经元，同时保持体内一定数量的神经干细胞，从而达到增殖和分化平衡。

　　最早期研究发现多细胞生物体中存在一类高度保守的细胞皮质极性蛋白（Par-3以及相关蛋白复合物）。Par-3极性蛋白复合物与Notch蛋白信号通路共同被发现一起在线虫和果蝇细胞的不对称分裂过程中起到关键决定作用（Guo and Kemphues, 1996； Jan and Jan 2001）。近期相关研究表明脊椎动物神经系统发育过程中一类主要的神经干细胞，radial glia progenitor cells（RGPs），的ACD体内调控很有可能是通过与非脊椎动物体内类似的信号通路完成。但是囿于脊椎动物胚胎发育中神经干细胞的高度多维调控及高分化特性，此外受制于对动物胚胎大脑进行高分辨率活体成像手段的匮乏，我们对于神经干细胞ACD过程中的具体信号调控机制一直并不清楚，很多推论和疑问也亟待证明。其中的一个核心问题是：存在于细胞皮质上的极性蛋白 （e.g., Par-3）是如何来调控细胞质及细胞核内大分子的不对称分布？

　　2021年6月11日，加州大学旧金山分校Su Guo教授研究组在Science Advances发文题为Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division（第一作者为 Xiang Zhao 博士）。该研究利用改进后的荧光抗体活体显微注射，成功地在斑马鱼胚胎前脑脑室实现了RGP 细胞Notch受体结合蛋白-DeltaD的活体染色标记。结合利用高分辨率快速扫描共聚焦显微镜，同时对特异荧光标记的DeltaD在神经干细胞ACD中的胞内动态分布特征进行了观测统计。该研究发现通过内吞作用进入RGP细胞endosome 的DeltaD蛋白在ACD过程中逐步被运输到具备增殖活性的子细胞。同时发现该子细胞往往是在斑马鱼前脑内顶端层水平分裂的RGP细胞产生的两个子细胞中处于尾向端的那一个，分裂完成后它会向基底层迅速迁移。该结果证实了之前在小鼠体内实验的推论，证明了脊椎动物前脑神经干细胞ACD的保守性。

　　同时该研究通过早期多细胞胚胎期显微注射，在对DletaD 进行标记的同时，也实现了对脑内单个RGP细胞进行Par-3-GFP体内荧光标记和同步观测。该工作首次展示了Par-3蛋白和DletaD在RGP细胞分裂过程共同被富集分配到具备干细胞增殖活性的尾向端子细胞的特性。当抑制胚胎体内Par-3表达后，RGP细胞的不对称分裂被显著降低，同时DeltaD 在分裂细胞内不再是定向转运，而更趋向于随机分布。该研究证实了Par-3能直接调控神经干细胞ACD过程中 Notch信号分子转运， 更进一步确定了Par-3蛋白对神经干细胞ACD子细胞的命运决定作用。

　　图1. A. anti-DeltaD (Dld) 荧光标记抗体注射示意图及在28小时斑马鱼胚胎前脑标记效果。B. 高分辨率共聚焦显微镜实时成像显示RGP细胞分裂全过程中胞内体内Dld特征实时动态。C. RGP细胞ACD全过程中胞内体内Dld时段性特征示意图。

　　该研究还进一步发现细胞动力蛋白同时也直接参与调控RGP分裂过程中的DeltaD定向运输。当利用药物抑制剂抑制细胞动力蛋白活性或者敲底细胞动力蛋白中间体的表达后，RGP细胞内的DeltaD的特征定向转运同步被抑制。结合组织免疫荧光染色和免疫共沉淀反应，该工作发现Par-3，DeltaD和Dlic1（动力蛋白中间轻链）在有丝分裂中晚期，呈现细胞质内共表达和结合特征。最为瞩目的是，该工作成功地在斑马鱼胚胎组织冷冻切片上实现了改进后的扩张显微镜技术（Label-Retention Expansion Microscopy），利用该技术将切片上的脑组织成功扩展了超过60倍体积，并实现了高灵敏度免疫荧光分子染色和高分辨率共聚焦显微镜扫描，最终图片成像分辨率达到了20纳米。通过该方法，在扩展后的RGP胞内成功观测到清晰的Par-3，Dlic1和DeltaD在转运过程中的胞内体上的三维分布结构。由此进一步阐释证实了Par-3通过与胞内动力蛋白结合对 Notch信号分子转运实现调控的机制。

　　图. A. 通过扩张显微镜技术（Label-Retention Expansion Microscopy）实现60倍扩张后的RGP细胞在高分辨率下呈现的胞内体上的Par-3，Dlic1和DeltaD三维分布。B. Par-3，Dlic1在RGP细胞内共同调控Notch信号胞内体运输机制示意图。

　　该工作首次描述并证实了细胞极性蛋白Par-3在RGP有丝分裂过程中存在于细胞质中，并直接调控细胞ACD信号的全部过程以及媒介，并进一步证实了脊椎动物之间保守的神经干细胞不对称分裂调控机制。该研究首次揭示了Par-3极性蛋白在干细胞胞内体转运过程的重要作用和机制，该研究将帮助我们更进一步了解该类细胞极性蛋白以及相关信号分子在胚胎发育，干细胞再生调控以及癌症发生中的作用。