广州生物院培育嵌入小分子药物调控基因剪刀的工具猪

　　近日，中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员赖良学课题组在《基因组生物学》（Genome Biology）上，发表了题为Doxycycline-dependent Cas9-expressing pig resources for conditional in vivo gene nullification and activation的研究论文，该研究构建了可通过小分子药物灵活调控基因剪刀蛋白Cas9表达的工具猪，利用该工具模型，实现了成体大动物体内高效基因编辑，并首次构建了大动物原发性可转移的胰腺导管腺癌模型。

　　猪不仅是重要的农业经济动物，也是重要的医学动物模型。随着基因编辑技术的发展，特别是CRISPR/Cas9技术的出现，越来越多具重要应用价值的基因修饰猪模型被培育出来。构建这些模型主要通过受精卵注射或体细胞核移植技术实现。然而，通过受精卵注射方式获得的基因编辑动物往往是嵌合体，需进一步的繁殖才能获得目标基因型，通过体细胞核移植方式获得基因编辑动物涉及复杂、低效的体细胞克隆过程，耗时、耗力且成本极高。

　　为了解决以上问题，赖良学课题组多年来致力于培育嵌入基因剪刀（Cas9蛋白）的工具猪模型，2017年，培育出了以Cre重组酶为开关来启动Cas9蛋白表达的工具猪，实现了对成体大动物直接进行体内基因编辑，并将该工具猪成功地用于原发性肺癌模型的建立（Genome Research，2017）。但该工具猪模型的应用需在体内递送入Cre重组酶，其过程复杂、昂贵，且效率较低。另外，Cre重组酶对Cas9蛋白表达的启动是永久性的，而Cas9蛋白在体内的持续表达，会引起基组织损伤、脱靶效应及免疫反应等不利影响。

　　四环素诱导基因表达系统可通过简单的小分子药物Dox灵活地调控外源基因的表达时间与表达量，且具简单、高效及易操作的特点。2022年，赖良学课题组通过基因编辑技术将该调控系统引入猪体内，培育出了Dox诱导外源基因表达工具猪模型，并证明了该模型对任意外源基因的可调控表达的有效性（Science China Life Sciences，2022）。该研究中，科研人员进一步将Dox诱导外源基因表达系统和Cas9蛋白一起嵌入猪体内，培育出具升级版基因剪刀的工具猪。

　　科研人员证实，小分子药物可对工具猪体内的Cas9蛋白表达时间和表达剂量加以灵活调控，即Cas9表达由药物施用与撤除加以启动和关闭，而表达量受给药剂量控制。另外，通过对怀孕母猪进行药物处理，小分子药物Dox可跨过胎盘屏障，实现胎儿体内剪刀蛋白Cas9的高效诱导表达。科学家进一步证实，诱导表达的剪刀蛋白Cas9不仅可以切割基因组，导致基因失活及染色体重排，还可采用截短失活型sgRNA及转录激活蛋白组合，实现内源靶标基因的表达激活。

　　为验证利用该工具模型进行体内基因编辑的效果，科研人员将包装有靶向两个抑癌基因（TP53、LKB1）的sgRNAs和人KRASG12D表达框的腺相关病毒通过胰腺导管和/或直接胰体注射至胰腺内，诱导产生致癌基因突变。21周后，猪出现明显的腹胀和摄食减少，PET-CT结果显示腹腔内出现明显的代谢信号异常，解剖结果显示，胰腺内出现大量肿瘤，且已转移至肝脏、肠及膈膜等器官/组织，组织切片结果也显示出现了典型的胰腺导管腺癌病理变化。

　　科研团队获得的Dox诱导Cas9表达猪模型，将为直接进行体内基因编辑、体内基因文库筛选及体内基因表达调控提供理想的工具。

　　另外，科研人员还在该工具基础上，通过时空调控Cas9表达，建立了一步体细胞克隆法即可获得能够稳定遗传的时空特异性单或多基因敲除猪模型的策略，为后续构建各种用途的新型条件性基因敲除猪模型提供了便利，也为细胞谱系示踪模型构建、基因治疗过程中Cas9蛋白的安全性评估等研究提供理想的工具。

　　研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、海南省重大科技计划项目、中科院青年创新促进会和中国科协青年人才托举工程项目等的支持。

Dox诱导Cas9表达工具猪模型培育与应用。（A）Dox诱导Cas9蛋白表达原理图；（B）原代Dox诱导Cas9表达工具猪照片；（C）基于Dox诱导Cas9表达工具猪构建原发性胰腺导管腺癌模型示意图；（D）原发性胰腺导管腺癌及其转移器官/组织照片；（E）Dox诱导Cas9表达工具猪的应用领域