iCIEFMS在线直联技术表征单克隆抗体的电荷异质性

　　前言

　　全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)电泳已成为生物制药领域治疗性单克隆抗体(mAb)电荷异质性分析的一项重要技术，无需传统CIEF方法的迁移步骤即可通过紫外实时成像的方式完成蛋白分离和定量检测。除了电荷异构体的定量分析之外，通过在线电喷雾电离质谱(ESI-MS)的方式直接表征分离的电荷异构体对于研究单克隆抗体的产品质量、安全性和有效性至关重要。iCIEF-MS串联技术将iCIEF的高分离效率与MS的强大的表征能力相结合，可以对单克隆抗体的电荷变体进行深度表征。

　　<本文节选并译自  Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusüß C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022;1–9.>>

　　单克隆抗体由于性质和制造复杂，容易出现结构异质性，特别是电荷异质性。单抗的储存降解也会产生电荷异质性，从而对结合效率和治疗效果产生潜在的负面影响。全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)技术在生物制药领域经常被用于电荷异质性的测定，在治疗性单抗的开发和质量控制中已经被公认为是一种非常可靠的常规方法。

　　iCIEF采用毛细管全柱成像检测(WCID)的方式监测抗体的分离过程并通过紫外法对抗体含量进行定量检测，整个检测无需传统CIEF方法的迁移步骤，在许多情况下已经取代了传统的CIEF方法而成为生物制药领域中电荷异质性分析的首选方法，因为它具有更优越的分辨率，没有迁移步骤，从而缩短了分析时间(每个样品<15分钟)，减少了费力的样品制备，以及更快的方法开发时间。

　　抗体电荷异质性的研究除了各电荷异构体的分离及定量之外，通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)技术直接表征分离电荷异构体，对于确保单克隆抗体的产品质量、安全性和有效性也至关重要。

CEInfinite iCIEF分析兼制备型全柱成像毛细管电泳系统

　　AES公司创新的分析兼制备的CEInfinite 全柱成像iCIEF系统，成功地实现了iCIEF与ESI-MS串联，通过将iCIEF的高分离效率和UV定量结果与MS的表征能力相结合，可以对单克隆抗体电荷异构体进行深度表征。只需简单的优化方法参数，就能成功地将单抗的各电荷异构体峰从iCIEF转移至MS分析。尽管电荷异构体峰从iCIEF转移出来的过程中会在一定程度上降低异构体峰间的分辨率，但借助高分辨的MS平台，即使是从低丰度的电荷异构体中分离出完整的单抗电荷异构体，包括脱酰胺、糖基化修饰等，都可以被高精度地表征出来。这就为生物制药应用中的单抗电荷异质性表征提供了巨大的潜力。

　　（1）iCIEF-MS串联系统的组成

　　图1A展示了CEInfinite和Thermo Orbitrap Fusion Lumos 串联的示意图。CEInfinite电泳系统包括一台自动进样器，一个用于加压迁移的蠕动泵，以及一个成像检测器(UV)、一个iCIEF毛细管卡盒（包含三个部分：进样毛细管、分离毛细管、转移毛细管）。iCIEF毛细管卡盒的进样毛细管端连接到自动进样器内的六通阀接口，转移毛细管端连接ESI接口。样品通过六通阀导入iCIEF毛细管卡盒的分离毛细管部分，两端的电极分别浸入阳极液和阴极液液面以下。电极施加高电压后，抗体在分离毛细管中完成iCIEF分离，之后由蠕动泵提供动力，将转移流速控制在10 ~ 80 nl/min(分离毛细管内径为200µm)，这时分离毛细管内的电荷异构体将依次被转移至ESI源电离并进行MS分析。

图1 (A) CEInfinite iCIEF与ESI-MS串联的原理图，iCIEF系统带自动进样器、注射泵、毛细管柱，毛细管柱出口连接ESI接口；(B) 曲妥珠单抗的iCIEF-UV谱图(浓度2 mg/ml)。聚焦电压:1500V (1 min)+3000V (10 min)。UV 280 nm 检测；(C) Orbitrap Fusion Lumos采集的曲妥珠单抗的总离子流图（m/z 1500-4000）。

　　（2）iCIEF-MS分析曲妥珠单抗

　　图2展示了曲妥珠单抗电荷异构体的iCIEF-MS分析结果。从图2A可看出共有4个电荷异构体的峰被分离并鉴定，包括一个碱性峰、一个主峰、两个酸性峰。图2E的主峰解卷积结果表明，主峰的主糖型(G0F/G0F)的质量为148 058.4 Da，与理论质量148 057.2 Da相差8 ppm。

　　图2D的碱性峰解卷积结果表明，碱性峰也含同样含有低丰度单糖基G0F、G1F和G2F，其完整分子量相对主峰差了−19.4 Da，这说明是由Asn (−17 Da)或Asp/isoAsp (−18 Da)形成琥珀酰亚胺。图2F显示了酸性峰#1解卷积结果，酸性峰#1的分子量与主峰相差+1.2 Da，酸性峰#2（图2未展示）的分子量与主峰相差+1.8 Da，这表明它们分别是经过单次脱酰胺修饰和两次脱酰胺修饰形成。

图2 iCIEF-MS分析曲妥珠单抗：(A) 曲妥珠单抗TIC-MS，m/ z1500-4000；(B) 主峰质谱图；(C) 主峰质谱图局部放大；(D) 碱性峰解卷积结果；(E) 主峰解卷积结果；(F) 酸性峰#1的解卷积谱结果。

　　（3）iCIEF-MS分析fusion mAb

　　图3展示了分子量190 KDa的融合单抗的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析结果。我们能清楚地看到UV和MS图谱中的各个电荷异构体峰能一一对应。这两个单抗主峰中含量最丰富的糖基G0F/G0F的分子量测定精度分别为15ppm(图3A)和18ppm(图3B)，SD分别为2 ppm(n=3)和3ppm (n=5)。尽管获得的质量精度较低，但较小的SD值仍能帮助我们可靠地测定主峰与碱性峰和酸性峰的质量差异。图3A中单抗碱性峰的质量与主峰相比差了−19 Da (SD 2 ppm,n=3)，图3B中的单抗碱性峰的质量差了−20 Da (SD 3 ppm,n=5)，表明该分子可能已在肽水平上进行了焦谷氨酸修饰(−18 Da)。酸性峰A1、A2、和A3的质量增加了6 Da，最有可能是因于脱酰胺形成的不同电荷异构体。

图3 融合抗体的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析结果

　　参考文献：略

　　原文请参考：Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusüß C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022；1–9.

　　https://doi.org/10.1002/elps.202200170

　　当然，如果要进行更深度的表征以确定修饰位点和修饰类型，仅仅依靠iCEIF-MS获得的完整分子量信息还不够，这时我们可借助CEInfinite的馏分收集功能，对iCIEF分离的电荷异构体馏分收集后进行酶解，再使用HPLC-MSMS进行肽图表征。

　　我们在下一期的iCIEF的专题中，将为您分享馏分收集功能在电荷异构体表征中的应用。