iPCR或混合PCR产物的SLIC亚克隆

实验概要

SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）是一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆新方法，它可以实现体外同源重组反应中多个DNA片段在单一反应中的装配和单链的退火。

实验步骤

1. 用限制性内切酶处理2微克载体，使用QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化载体并分离DNA，对载体进行定量。

2. 使用Taq DNA聚合酶扩增片段，设立100μL 的PCR反应体系：250μM dNTP，0.5 μM 引物和 2.5 U Taq DNA聚合酶(Eppendorf公司)。反应周期如下：94°C 45秒，(94°C 45秒，54°C 45秒，72°C 1分钟，30周期)； 72°C10分钟，PCR扩增后加入20U Dpnl 至100μL PCR产物中，37°C孵育1小时。通过QIAquick PCR纯化柱纯化PCR产物，对PCR产物进行定量。

3. 应用于iPCR产物插入时，PCR产物加热至95°C，5分钟进行变性，1小时内慢慢冷却至室温进行复性，稀释，并进行退火反应。对于混合PCR产物插入，两个PCR产物等量混合，加热至95°C，5分钟进行变性，1小时内慢慢冷却至室温进行复性，稀释，并进行退火反应。

4. 1微克的载体和0.5U在T4缓冲液(NEB)中的T4 DNA的聚合酶，再加上BSA在20μl反应体系在室温下反应30分钟。加入1/10体积的10 Mm dCTP停止反应，冰浴。

5. 建立一个10μl的退火反应体系，插入片段与载体的比例为1:1或者更高，其中含有150纳克3.1 kb的载体(0.074 pmol)、1倍的连接反应缓冲液，适量的插入片段和水。37°C孵育30分钟后置于冰上或储存于-20°C 。

6. 将上述反应混合物5μL加入到150微升 BW23474化学感受态细胞中，冰上孵育30分钟，后于42°C 处理45秒进行热休克，重新置于冰上2分钟，加入0.9毫升的SOC，并在37° C处理1小时进行恢复。

7. 将100μL上述反应液加至含有适当的抗生素反应板中，37℃孵育过夜。