纳米孔测序搞定超级难搞的基因

　　Brenton Graveley是在2014年4月收到他的第一台MinION测序仪的。他所在的康涅狄格大学实验室是首批获得Oxford Nanopore Technologies测序仪的客户。尽管准确性不稳定，通量也不高，但Graveley和他的同事决定立刻就试试。

　　对于MinION，众多讨论都集中在它的迷你尺寸：早期的试用者将它带到疫情爆发区和热带雨林。不过对于Graveley来说，MinION读取的DNA链长度与测序仪本身一样让人激动。大多数测序仪依赖化学反应，随着时间的推移容易出错，这意味着只能读取短片段的DNA。MinION则是在DNA分子穿过狭窄的纳米孔时观察它们，只要DNA穿过，它们就产生数据。

　　在一篇发表在《Genome Biology》的文章中，Graveley和两个实验室成员，Mohan Bolisetty和Gopinath Rajadinakaran，证明了这些读长如何帮助他们解释Dscam1的行为。这是个很难对付的基因，在形成昆虫大脑的结构时起了关键作用。这个基因可产生数千个略微不同的蛋白质，很难用常规的测序技术去了解。

　　绝望的转录组

　　Graveley的实验室研究了转录组。他们特别感兴趣的是那些RNA分子可以采取不同的形状，或异构体，这是随机的，或取决于细胞在特定时间需要什么。通过选择性剪接的过程，不同的亚基组成了基因。许多基因有两个或更多的互斥外显子，而那些表达为RNA和蛋白质的外显子对细胞行为有着重大影响。

　　作为果蝇中选择性剪接的世界纪录保持者，Dscam1带来了非凡的挑战。Dscam1由115个外显子组成，其中只有20个总是转录成RNA。另外95个存在于四个相互排斥的外显子簇中，因此，人们预测Dscam1可能有超过3.8万个异构体。

　　“到目前为止，这个数量级超过了其他任何一个基因，”Graveley解释道。这种灵活性也许有助于了解Dscam1的功能。它产生的蛋白质帮助识别昆虫大脑中的单个神经元，让它们不同于它们的邻居。在一些实验中，Dscam1经过改造以产生较少的RNA异构体，结果使果蝇发育过程中的神经连接遭到破坏，严重时甚至造成死亡。

　　Dscam1也在昆虫的免疫系统中发挥作用，这是它产生众多异构体的另一原因。在对付某些病原体时，每个分子都或多或少有效。然而，要弄清楚特定样品中存在哪些异构体，这不是一般的难。Graveley已经研究了十多年，但还是无法回答一些基本的问题：一些异构体是不是更常见、更重要？理论上的异构体全都表达吗？

　　读长的困扰

　　即使是那些先进的测序技术，它们一次也只能读取几百个DNA碱基。然而，许多基因的选择性剪接发生在mRNA前体分子的多个位置，它们可能相距几千个碱基，大大超过了这些测序平台的读长。目前还没有办法填补这些缺口。

　　Graveley尝试了很多方案。他甚至用了过时的Sanger测序方法，虽然很慢，也很费力，但能跨越更长的读取。实验室也尝试用Illumina测序仪来重建RNA转录本。“这确实有用，”Graveley说，“不过许多文库制备的假象使其更加复杂。”

　　Graveley的首选方法是使用Pacific Biosciences的测序仪。它像MinION一样，是基于长读取的单分子技术。PacBio测序比纳米孔更加成熟，结果也相当可靠。此外，它有着高的通量。对于研究选择性剪接的研究人员来说，这无疑是理想中的技术。不幸的是，它太贵了。因此，Graveley的团队想看看，MinION是否能作为一个替代选择。

　　在这篇文章中，他们聚焦了Dscam1 RNA上一段1.8 kb的区域，它覆盖95个选择性剪接外显子中的93个。为了获得样品，他们捣烂了果蝇的头部，从中分离出Dscam1 RNA，并逆转录成cDNA进行测序。他们还测序了其他三个选择性剪接的基因，Rdl、MRP和Mhc。

　　选择性剪接

　　Graveley对MinION的最大担心是它那不稳定的准确性。尽管大多数测序仪都能轻松达到99% 以上的准确性，但他的小组在MinION平台上只达到90%。这其实已经比大多数用户要好了。因此，用户必须考虑到这一点：这个设备在重测序项目中相当可靠，但对于de novo测序，它还有待观察。

　　为了确定确切的转录异构体，MinION并不需要完美读取每个RNA分子，它只要将外显子区分开就行了。对于Dscam1，这些外显子可能有80%是相同的。事实上，Graveley及其同事发现，MinION确实能做到这一点。

　　在大约33,000个高质量的Dscam1读取中，几乎29,000个完美匹配。为了进一步检查其准确性，研究人员在Illumina平台上测序了同一个样品。尽管Illumina测序不能给出完整的异构体，但它显示出相同比例的外显子，说明MinION能给出一幅完整且无偏向的图画。

　　“结果表明，选择性剪接或许是这个平台的理想应用之一，”Graveley谈道。“即使是一个这么复杂的基因，我们也能准确区分异构体。除非你的外显子非常非常小，或者两个外显子几乎完全相同，否则这种准确性都是足够的。”