GEN：引领癌症免疫治疗的“四驾马车”

　　近些年来，一场癌症治疗的革命正在悄然发生，除了依赖于一种又一种的人工分子来诊治癌症，科学家们正在寻求通过病人自身免疫功能治疗恶疾的方式。

　　现在，癌症免疫疗法主要面临着三大任务：增强癌细胞免疫靶标性，提高特异免疫分子的癌细胞击杀率以及提高免疫细胞的肿瘤靶向性。

　　自肿瘤免疫治疗出现伊始，这一领域便处于不断进化的状态，现在，肿瘤免疫治疗领域的相关实验已经在各大实验室得到了开展，肿瘤免疫的通路分析引导着临床疗法的不断发展，同时也在很大程度上提高了癌症的治疗水平。

　　为了进一步了解肿瘤的免疫疗法，我们必须了解免疫系统如何产生针对肿瘤细胞的特异反应。在这一系列反应中， T细胞扮演着最为重要的角色，在肿瘤免疫过程中对来自各种癌细胞的信号分子产生特异反应。

　　1. T细胞的主场

　　西雅图生物公司Adaptive Biotechnologies合伙人和首席科学家Harlan Robins博士表示，“生物体各个细胞遗传物质完全相同的理论对于T细胞与B细胞来说并不完全适用，T细胞B与细胞在人体内会产生大幅度的DNA重排。”

　　免疫学家把这一过程称为VJD重排，这一过程主要发生在T淋巴细胞发育的过程中，对三个基因区域产生一定程度的影响（可变区V，多样区D以及连接区J）。这种基因重排直接导致了T细胞表面抗原特异性受体结构的多样性，其中便包括针对于肿瘤细胞表面抗原的特异受体结构。

　　如何使用PCR量化的免疫细胞的克隆多样性

　　大多数情况下，癌症免疫疗法所面临的最突出问题集中在刺激免疫系统攻击癌变细胞。科学家们意识到除非能够有效促进病人体内无性分裂的多样T细胞发生定向分化，癌症免疫治疗都有效实施都会变得格外艰难。为了解决这些问题，现有的诸如光谱分型等技术是远远不够的。2007年，当Robins博士和他的同事们开始开发免疫治疗技术的时候，业内立足于传统理论报道T细胞受体编码序列的相关文献只有约1万篇。

　　Robins博士回忆说，“当年肿瘤免疫领域的相关研究并为与高通量测序技术结合，而现在，高通量测序技术使我们能够更加清楚而深刻地认识T细胞表面受体编码序列。”

　　Robins团队的首次实验便得到了6百万个T细胞表面受体编码序列，这样的实验结果也在某种程度上使Robins团队的研究规模发生了极大的变化。Robins团队在随后开发了更为先进的多倍测序技术用于免疫系统的测序工作，进而促进了免疫治疗序列分析领域产生与发展。“在我们之前，没有任何人做到如此大量的多重PCR。”Robins博士强调。

　　Adaptive Biotechnologies的主力产品ImmunoSEQ assay使用几百个引物对T细胞多样性克隆产物进行量化分析。通过这项技术，科研人员和临床医师可开发针对于某种特异循环流细胞表面抗原的特异T细胞克隆。

　　Robins 博士解释说，“很明显，你很难得到病人的肿瘤样本，但是你可以轻松获得他们的血样。”因为能够特异免疫细胞在病人体内起到预期作用，ImmunoSEQ assay已经被应用于白血病的临床评估，基于单个患者T细胞或B细胞的大量扩增来直接追踪患者的白血病。

　　最终，Robins博士团队希望在治疗干预之前、之中以及之后对T细胞克隆体的不同变化进行监控。研究团队甚至开发了一种肿瘤渗透淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte ，TIL)化验来研究对肿瘤具有明显趋向性的T细胞扩增。

　　2. 循环肿瘤细胞

　　Daniel Adams, Creatv MicroTech资深研究科学家说“几年前，人们仅仅对肿瘤中发生着什么有兴趣。而现在，人们逐渐开始关注癌症患者中免疫系统对肿瘤的特殊反应。”

　　与Adams研究方向类似的科学家们一直在研究着肿瘤细胞与肿瘤细胞改造而成的基质细胞，同样，这些科学家也在研究着非适应性免疫反应，直接检测癌症患者血液成分随时间的变化。

　　“我们不能在每年都和每次他们发病的时候对研究对象做二次活检，现实条件很难允许我们做到对单个患者的长期研究。”这一现状在某种程度上直接导致了Creatv MicroTech在马里兰与新泽西建立分公司，该公司开发的细胞过滤器CellSieve通过更先进的内置聚合物与工学设计对传统技术进行了极大的提高，能够更高效地对循环瘤细胞与其他基质细胞进行分离，用于后续的临床分析。

　　“癌症患者进行免疫治疗的过程中，病人的抵抗力会得到重建，癌变则以不同亚型的方式重复发生。在治疗几年之后，原发肿瘤团块将不会再具有分裂与增值能力。”Adams表示。

　　虽然循环瘤细胞在病人血流中数量极微，每5至10毫升血液中仅有一两个循环瘤细胞。虽然这些血液中的循环瘤细胞活性极低，他们对于癌症患者与临床医师来说具有不可替代的预诊断价值。

　　“我们在两年间对30多位乳腺癌患者进行了调查，循环瘤细胞成功分离患者的两年内死亡率高达90%，两年半内的死亡率高达百分百。”Adams表示。

　　此外，现有的技术使得对癌症免疫反应的追踪成为了可能。通过检查基质细胞，CellSieve滤过装置可对不同的细胞流进行收集与检测，进而对集体免疫反应进行评估。

　　Isolation, culture and expansion of cells isolated on CellSieve?. (A) MCF-7 cells spiked into vacutainers, isolated by filtration and cultured on CellSieve for 2-3 weeks. A 3 dimensional cluster attributed to this cell line is seen on the filter. (green=anti-cytokeratin, blue=DAPI) (B) PANC-1 cells spiked into vacutainers, isolated by filtration and grown on CellSieve for 2-3 weeks. PANC-1 is seen growing as a monolayer on the filter. (C) SKBR3 cells are spiked into blood, filtered by CellSieve. The CTCs are identified by presence of anti-cytokeratin and anti-EpCAM, and absence of anti-CD45. After CTCs are counted, cells are subtyped by HER2 FISH. (D) SKBR3 cells are spiked into vacutainers, isolated by filtration and grown on CellSieve for 2-3 weeks. Expanded colonies were directly analyzed as a whole colony and as individual cells, molecularly by HER2/CR17 FISH probes. (E) Circulating stromal cell, e.g. a 70 ?m giant cancer associated macrophage can be identified for clinical use, myeloid marker in red. (F) A cell of interest can be identified and restained with immunotherapeutic biomarkers, e.g. PD-L1 (green) and PD-1 (purple). (G) After filtration, cells were identified with histopathological stains (e.g. H&E) for cytological analysis. (H) After H&E, external cell structures were analyzed by SEM. [Creatv MicroTech].

　　目前，许多研究进展有效地支持了肿瘤发育环境基质细胞与肿瘤细胞共同进化的推论，指出基质细胞标记物的变化能够在很大程度上反应肿瘤细胞的代谢变化。而对于循环系统中肿瘤细胞与基质细胞的检测与分析可以在为研究人员与临床医师提供大量的病理学、生物标记以及分子生物学参考。

　　3. 抗癌试验

　　在目前的癌症生物学领域中，大量不同的技术仪器扮演着不可或缺的角色。技术仪器的发展促进着诊断技术的进步，而后者的进步也在更大程度上催生着仪器开发与制造商的不断创新，免疫与肿瘤诊断技术进展在很大程度上体现了这一技术与经济的良性循环。随着肿瘤免疫治疗的不断发展，肿瘤的免疫治疗将与癌症生物学充分结合，补充与丰富现有的产业资本循环形式。

　　ACEA Biosciences技术转化科学家Brandon Lamarche博士说:”毋庸置疑，免疫治疗将在未来的癌症治疗中扮演不可或缺的角色，不论具体的实现形式如何，有效的癌细胞免疫杀伤实验都是这一行业走向顶峰所必须的标志。”

　　位于圣迭戈的技术公司ACEA Biosciences开发了一种微量滴定板，这种滴定板的底部约75%的面积涂布着金属电极。ACEA的酶标仪xCELLigence可通过电极阻抗变化来对细胞形态与生存能力进行检测与评估。研究人员可以通过相关试剂或非粘着性免疫细胞悬浮液对癌细胞进行追踪与功能检测。

　　Lamarche博士认为xCELLigence技术系统有效地解决了细胞杀伤实验所面临的一些问题。通过xCELLigence，研究人员与临床医师可以获得细胞代谢的全波段光谱。ACEA认为xCELLigence将会成为癌症患者临床细胞杀伤实验的新标准。

　　4. 肿瘤免疫治疗的生物信息学

　　从病情监控到疾病治疗，癌症免疫治疗领域每时每刻都离不开生物信息学的辅助。目前，全球著名信息服务供应商汤森路透的分析师们正在通过编译数据档案和应用先进的分析技术寻找新的免疫治疗靶标。汤森路透生命科学部首席科学家Richard Harrison医生表示，“从本质上来说，在药物开发的每一个阶段，我们都有一个专门的数据库与之关联。”

　　汤森路透的分析师以及诸如MedaCore与Cortellis的编译数据库都向客户提供与他们科研或临床服务相关的技术支持。“我们可以获取客户的有关数据，使用我们的工具与技术手段帮助他们充分了解他们数据所包含的一切信息。”Harrison博士表示。

　　汤森路透对策科学家Matt Wampole博士致力于与客户合作，帮助他们了解与熟练使用该公司的技术产品。“我们拥有许多在这一领域经验丰富的专家学者，诸如生物统计学专家，专业的数据监控师与数据分析师将为顾客提供诸如模型识别、患者分层、机制解析与病理深入研究等相关服务。”

　　Harrison医生对汤森路透的相关工作总结如下：“我们寻找癌症免疫治疗过程中的主要调控分子并将之作为治疗靶标以及生物标记，通过分析与比对患者与策划数据库的基因签名来对患者进行深度分类，进而为他们提供最佳的个性化用药与治疗指导。”

　　“我们正与数家制药公司开展合作，将我们的方法付诸于临床实践。目前，我们的研究与治疗方法已经在几个科研项目中得到了应用，其中包括通过细胞系数据分析预测癌症患者药物反应与胶质母细胞瘤患者分层。”Harrison说。