利用CRISPR来对付HIV：激活它还是去除它？

　　全球感染慢病毒HIV-1的人数已经超过了2500万。如今，人们可利用抗病毒疗法来控制HIV-1，使得病毒在血液中检测不到。不过，病毒没有完全消失；它只是隐藏在潜伏感染的细胞中。为了真正治愈HIV-1，研究人员需要打败这些隐藏的病毒库，而CRISPR有望完成这一艰难的工作。

　　美国天普大学Kamel Khalili的实验室证明，利用CRISPR来对付HIV有两种可能的策略：利用dCas9-SAM来激活HIV-1的转录并摧毁被感染的细胞；利用野生型的Cas9从被感染的细胞中去除HIV-1基因组。Mary Gearing在Addgene的博客上介绍了如何在体外利用CRISPR来对付HIV-1，以及临床上必须克服哪些障碍。

　　抗逆转录病毒疗法

　　HIV-1感染免疫系统中的细胞，特别是CD4+ T细胞，最终导致个体患上获得性免疫缺陷综合征（AIDS）。抗逆转录病毒疗法（ART）几乎可以消除血浆HIV-1，提高HIV-1患者的预期寿命和生活质量。不过，ART并不能治愈HIV-1。在停止治疗后，患者的病毒水平会迅速恢复到治疗前的水平，因为潜伏感染的细胞中存在病毒库。

　　同时，虽然患者检测不到血浆HIV-1，但其他慢性病的风险增加，包括痴呆、肠紊乱、神经损伤以及心脏病。为什么机体不能激发免疫反应来摧毁这些病毒库？实际上，免疫系统根本没有到威胁。潜伏感染的细胞很少产生病毒蛋白，因而逃过了免疫检测。为了解决这个问题，人们提出了两种策略。

　　激活并杀死

　　为了激活并杀死HIV感染的细胞，研究人员之前使用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂来增加HIV-1基因组的转录。在靶向方法中，Zhang等人利用了CRISPR/Cas9协同激活介质（SAM）系统。这个系统利用dCas9-VP64来激活转录，并借助两个激活结构域（MS2和p65）来增强转录激活。

　　Zhang等人设计了多个gRNA来靶定HIV-1基因组的5’-LTR，并发现SAM靶定在NF-KB结合位点附近的增强子区域，能增强HIV启动子-荧光素酶重组子的激活。在多个HIV-1潜伏T细胞系中，用CRISPR/Cas9 SAM治疗能增加HIV-1激活的比例。在能够产生HIV-1毒性蛋白的细胞系中，CRISPR/Cas9 SAM导致细胞凋亡，说明了真正的“激活并杀死”反应。

　　将HIV-1赶出去

　　之前有人利用锌指核酸酶（ZFN）来切割HIV-1基因组，不过研究人员认为CRISPR/Cas9可以提高效率，并降低脱靶效应的可能性。在这种疗法中，CRISPR/Cas9需要切割每个感染细胞的HIV-1基因组，并预防那些细胞的再次感染。Kaminski等人设计了靶定HIV-1 5’和3’-LTR的gRNA，并与Cas9一起表达。PCR扩增和Sanger测序表明，大部分的HIV-1基因组都已被切割，只有小部分的LTR连在一起。重要的是，未检测到脱靶效应。研究人员观察到，Cas9/gRNA的表达对细胞活力、细胞周期进程或凋亡没有负面影响。

　　Kaminski等人接着在HIV-1感染的T细胞中检测了他们的方案。他们从健康个体中分离CD4+ T细胞、扩增，并用HIV-1感染。对于两种HIV-1病毒株，Cas9/gRNA慢病毒表达明显降低了HIV-1拷贝数，不过病毒株之间的效率差异达48-100%。此外，对于从两名HIV-1感染患者中分离出的CD4+ T细胞，CRISPR也让HIV-1拷贝数降低50%以上。尽管这是个激动人心的结果，但需要注意的是，这些患者是是ART-naive的，因此这个实验模拟了HIV-1活性感染期，而不是大多数患者的ART诱导的病毒控制。

　　CRISPR HIV-1治疗的障碍

　　这两种方法都代表了HIV-1临床前研究取得了令人振奋的进展，但很难说哪一种方法会成功。“激活并杀死”的优势在于杀死被HIV-1感染的细胞，且不需要功能Cas9核酸酶，因此无异常DNA切割的可能性。直接的HIV-1切割允许T细胞存活，但为了防止再感染，需要持续表达Cas9/gRNA，这可能会造成较高的脱靶效应。

　　在这两种情况下，将体外工作转移到动物模型有两个主要障碍。第一是如何将CRISPR导入所有靶细胞。考虑到病毒库覆盖多个器官系统，这个目标很难实现。在感染的早期，当HIV-1限于一部分T细胞时，这两种方法都更为成功，但不清楚是否有足够的T细胞来销毁一个病毒库。

　　第二个挑战是序列特异性。抗病毒疗法在蛋白结构水平上靶定HIV-1，但CRISPR gRNA需要DNA序列的特异结合。患者的HIV-1基因组需要经过测序，才能确定最佳的gRNA，且每个gRNA需要经过验证，以确保高的on-target结合和低的off-target结合。HIV-1也可能对CRISPR疗法形成耐药性。多个gRNA有望解决这个问题。

　　就目前而言，尽管将这些研究成果转化成疗法还存在一定的困难，但这些文章呈现出了激动人心的证据，说明治愈HIV-1也许是我们力所能及的。未来，随着CRISPR体内导入取得进展，这有望为许多常见病的治疗带来可能。