外显子测序发现急性红细胞白血病新突变

　　急性红细胞白血病（AEL）是白血病（AML）亚型中的一种，在老年人白血病中的占比较高。相对于其他类型的AML，AEL病人有更加poor-risk的细胞遗传学异常和不良的预后。虽然针对AEL的外显子突变位点发现已有一些报道。但是，针对AEL的完整突变谱发现还没有相关报道。研究人员运用外显子组测序技术，发现了AML相关的高频突变基因GATA2和CEBPA等突变，为理解急性红细胞白血病的发生发展过程提供了新的证据。

　　研究思路

　　研究结果

　　1. 外显子组测序筛选AML相关高频突变

　　为了筛选和AML相关的特异性高频突变，研究人员对158个临床AEL病人（91个男性，67个女性）进行了详细的临床分类（37个MDS-AEL，108个N-AEL，13个AML-MRC）和细胞遗传学特性分析。然后运用全外显子测序（由上海伯豪二代测序平台提供），研究人员对其中的6个AEL样本及其remission样本进行了体细胞突变分析，共发现了436个白血病相关的涉及到288个基因的非同义突变（428个错义，8个无义突变）。其中，有45个突变多次出现，包括4个case出现CEBPA突变，2个case出现GATA2突变。

　　接下来，研究人员在58个AEL病人中（29个N-AEL，9个AML-MRC，13个MDS-AEL，7个普通AEL）进行了GATA2，CEBPA，NPM1和FLT3-ITD的18个突变的Sanger测序验证。结果显示，有42个病人中有17个携带一个突变，25个携带2个突变，6个携带3个突变，3个携带4个突变。其中，CEBPA突变频率为32.7%，GATA2突变频率为22.4%，NPM1突变频率为15.5%，SETBP1突变频率为12.1%，U2AF1突变频率为12.1%。值得注意的是，在AML发现的突变（IDH1，IDH2和RAS）并没有在AEL中出现。

　　GATA2是一个和造血功能相关的锌指转录因子，在该研究中共有13个AEL出现突变。分析显示，这些突变影响7个不同的氨基酸区域。其中，10个病人的突变位于N-terminal ZF1,3个病人的突变位于转录激活区域（Q20H），12个病人的突变为错义突变，其中又有9个位于DNA-binding N-terminal zinc-finger区域。

　　此外，为了探究GATA2与血液病的关系，研究人员对253个non-AEL AML,40个慢性骨髓白血病，55个B细胞白血病和38个T细胞白血病人进行了检测。结果显示，只有5.5%的non-AEL AML和15%慢性骨髓白血病发生突变。因此，GATA2是AEL特有的高频突变。

　　2. GATA2 ZF1突变模型分析

　　为了更加深入地理解GATA2突变对蛋白水平的影响，研究人员对AEL的GATA2 ZF1突变模型进行了分析。结果显示，P304，A318，L321，R330区域是GATA家族蛋白保守区域，对DNA-binding功能非常重要。根据已有对gata3蛋白晶体结构的发现，研究人员构建了3个gata3蛋白晶体结构（PDB code 4hc9, 4hca and 4hc7B）。结果显示，P304, A318, L321和 R330的突变残基都位于gata2的蛋白表面，是直接与DNA结合的部位。因此，在这里发现的GATA2突变削弱了该蛋白与DNA的结合能力。

　　3. GATA2突变的功能研究

　　既然GATA2的突变影响了蛋白与DNA的结合能力，那么，这种变化对细胞的功能有什么影响？研究人员在293T细胞中共转了GATA-responsive reporter（wild type和mutants）。结果显示，转染mutants时，转录活性降低。当共转Wt-GATA2和突变R330X-GATA2时，Wt-GATA2转录活性显著降低，暗示着R330X-GATA2包含Wt-GATA2的负调控dominant。当在小鼠骨髓细胞32D 中过表达GATA2突变时，红细胞相关抗原，Ter-119,β-globin,βh1-globin表达增加，血红蛋白positivity增加。

　　因此，该结果表明，GATA2突变影响了血红细胞的发育过程。

　　研究结论

　　本研究通过外显子组测序，发现了AEL相关的特异性体细胞突变。其中，对GATA2的大样本验证及不同类型白血病样本验证，表明其实AEL所特有的高频突变。此外，通过突变转染的细胞实验研究表明，GATA2的突变影响力红细胞的发育过程。该研究为理解急性红细胞白血病的发病机制提供了新的证据。