新一代的遗传筛查–CIRSPR与单细胞测序的强强联合

　　遗传筛查是研究哺乳动物细胞中基因功能的强大工具。将基因扰动与细胞表型相关联，目前主要有两种方法：芯片筛查和混合筛查。芯片筛查能揭示高分辨率的表型，但其通量有限且价格不菲。混合筛查则能够快速筛查数千个扰动，效率高，扩展性好，但它不能揭示每个扰动的详细表型。

　　如今，四项近期发表的研究为遗传筛查带来了第三种选择，将芯片筛查和混合筛查的优势相结合。三个独立的研究小组开发出CROP-seq、CRISP-seq和Perturb-seq技术，它们利用CRISPR-Cas9系统在单个样品中平行生成数千个基因扰动。之后利用单细胞RNA-Seq，同时测定每个细胞的扰动和表型。

　　这些新方法将丰富的表型信息与每个特定扰动相关联，实现了大规模的单细胞转录谱分析。奥地利科学院的Christoph Bock表示：“这些方法建立了一种新的高通量筛查范例，结合了混合筛查与芯片筛查的主要优点，从而有助于我们更有效地探索新颖的生物学机制。”

　　Perturb-seq

　　在《Cell》杂志上发表的两项研究中，加州大学旧金山分校的Jonathan Weissman和Broad研究院的Aviv Regev介绍了一种称为Perturb-seq的新方法。Broad的团队使用这种方法分析了20万个细胞，重点在调控树突状细胞反应的转录因子。Perturb-seq准确鉴定了受扰动影响的单个基因靶点、基因特征和细胞状态。

　　Weissman实验室的博士后研究员、其中一篇文章的共同第一作者Britt Adamson表示：“Perturb-seq填补了当前功能基因组学研究的一大缺口。它提供了一种革命性的工具，能够快速系统地剖析细胞中所有主要的转录通路。”

　　这种基于CRISPR-Cas9的方法依赖设计的向导RNA来实现靶向的基因组编辑。据作者介绍，主要的瓶颈在于开发细胞条形码策略，以便准确捕获哪个向导RNA在特定细胞中表达，以及哪个基因被扰动。他们的研究十分了不起，在扩大单细胞数量的同时，还能够将扰动准确分配到每个细胞。

　　CRISP-seq和CROP-seq

　　在同一期的《Cell》杂志上，以色列魏茨曼研究所的Ido Amit团队应用新方法CRISP-seq来探索先天免疫的调控回路。他们采集了数万个受扰动的细胞，并鉴定了控制骨髓细胞分化及其对病原体反应的调控网络。据作者介绍，结果表明CRISP-seq可以作为一种通用方法来探索哺乳动物细胞的调控，同时有望用于未来免疫细胞的改造。

　　在这几篇文章发布后不久，Bock及其团队在《Nature Methods》上介绍了一种新方法：CRISPR液滴测序（简称CROP-seq）。这种方法结合了四大关键要素：向导RNA载体，高通量的单细胞RNA-seq检测，分配单细胞转录组的计算管道，以及分析和解释向导RNA诱导的转录图谱的生物信息学方法。与Perturb-seq和CRISP-seq相比，CROP-seq的优势在于能直接读取向导RNA，这大大简化了单细胞CRISPR筛查，使其与混合筛查中的标准克隆方案完全兼容。

　　尽管这种方法目前仅支持单细胞RNA-seq，但单细胞多组学方案很快将投入使用。在未来的研究中，Bock及其团队打算利用CROP-seq来开展癌症研究，探索表观基因组编辑的潜力。他们的计划是在正常细胞中引入特定的表观遗传缺陷，将它们转化成癌细胞，从而证明表观遗传在癌症中的作用。同时，他们也有意将癌细胞重编程为恶性程度较低的细胞，希望找出那些调节细胞命运而不是杀死所有细胞的潜在治疗方法。

　　机遇与挑战

　　与之前开发的方法相比，这些新方法具有明显的优势。首先，它们提供了一种通用型检测，可同时捕获各种表型，而不依赖生物标志物。对于之前那些难以开展混合筛查的应用，它们能够轻松胜任。其次，这些方法还能充分利用CRISPR-Cas9系统的灵活性，比如基因沉默（CRISPRi）或激活（CRISPRa）。

　　从临床的角度来看，这些方法有望直接应用在包含数万个细胞的活检样本上。“将单细胞CRISPR技术用在复杂的异质组织上，这将是令人兴奋的，如原发性肿瘤，其中每种细胞类型对治疗药物都可能有不同的反应。通过单细胞CRISPR测序，我们现在能检测同一肿瘤中的不同细胞是否依赖不同的基因来应对化疗，”Bock说。

　　当然，这些方法也有一些实际的问题。据Bock介绍，一个问题是单细胞RNA-seq的成本太高，使得目前的筛查规模限制在1000个目标基因。不过正如Dixit所指出的，这一成本有望随着时间的推移而下降。“在过去几年，单个细胞的测序成本下降了100倍，在未来几年可能还会下降10-100倍，”Dixit说。目前，开展全基因组范围筛查的成本大约是10万到100万美元，具体取决于你想要哪些细节。

　　在技术层面，Weissman及其团队正在努力简化和扩展他们的方法。通过改进一些方面，他们相信能提高效率，并降低成本。他们还计划继续改进计算方法，以便更好地了解数据。“尽管这项技术还很年轻，但若扩展到全基因组规模的功能基因组学，并没有内在的限制，”Weissman说。