又一华裔新星Nature发文报道成像技术重大突破

　　来自美国哥伦比亚大学的研究人员报道了一种全新的成像技术：电子预共振受激拉曼散射显微镜（Electronic Pre-Resonance Stimulated Raman Scattering Microscopy）。这一技术结合了拉曼散射光谱窄（～1 nm）以及荧光分析灵敏度高的优点。研究人员利用这种荧光成像技术，发现了24种颜色各异的探针，展示了多达16种颜色的活细胞成像和8种颜色的脑组织成像。

　　这一研究成果公布在4月19日的Nature杂志上，文章的通讯作者是哥伦比亚大学化学系闵玮教授，闵玮早年毕业于北京大学，2008年在哈佛大学获化学博士学位，导师为美国科学院院士谢晓亮教授，之后在其课题组从事博士后研究。闵玮博士现任哥伦比亚大学化学系终身教授，研究成果多次发表在Nature Method、PNAS等国际学术期刊，因其科学贡献获得过很多奖项，其中包括2013年的斯隆研究奖。

　　近年来，显微镜技术在不断地突破自身的局限。2000年以来兴起的超分辨荧光成像技术，已经突破了光学衍射极限。2015年，闵玮研究组开发出一种新的方法，即基于受激拉曼散射（SRS）成像，可视化单细胞内的葡萄糖摄取活性，并展示了其在肝癌细胞、肿瘤异种移植组织、原代神经元及小鼠脑组织中的应用。这是亚细胞分辨率的一个突破。

　　电子预共振受激拉曼散射是拉曼散射的一种特殊形式。拉曼散射信号通常很微弱，受激拉曼散射通过两束满足共振条件泵浦和斯托克斯激光与分子特定振动发生特异性耦合来增强信号。受激拉曼散射和生物成像的结合是由哈佛大学谢晓亮教授首次在Science杂志报导，闵玮博士就是其中的主要发明人，谢晓亮教授曾表示，他想在无荧光标记的情况下增加拉曼光谱的灵敏度，甚至来检测单分子。但是这个项目实在太难了，谢晓亮几乎无法说服学生们来尝试，最终是闵玮接受了挑战，他与一位德国的研究生Chris Freudiger取得了突破：通过探测受激拉曼散射信号获得了无需荧光标记的生物医学显微图像。

　　自此之后，这一技术被广泛应用在生命分析研究中。电子共振拉曼散射则是另一种增强拉曼信号的方法：当泵浦激光的频率接近分子的电子能级跃迁频率（即吸收波长）时，与电子能级跃迁耦合相关的分子振动光谱也被选择性增强。因此，将电子共振拉曼散射和受激拉曼散射结合，可以极大地提升拉曼信号。

　　然而当泵浦激光频率严格等于分子的电子能级跃迁频率时，分子不但会经历电子共振受激拉曼散射，同时也有其他的泵浦-探测过程干扰检测信号。在这篇文章中，研究人员发现当泵浦激光频率略低于分子的电子能级跃迁频率（实验发现与分子吸收峰相差2100波数左右）时，可以在实现最大的信号增强的同时，避免检测背景的干扰。

　　这项技术就是电子预共振受激拉曼散射，可以将以前普遍使用的无共振的受激拉曼散射信号提升1000倍左右，1毫秒内的对应检出限在250 nM，从而可以胜任大部分生物分子的成像分析。

　　之后这一研究组着力于寻找和开发合适的分子探针。由于选用的泵浦激光器波长在900 nm左右，其对应的预共振拉曼探针吸收波长在650-750 nm时，可以实现最佳的信号提升。这个波长段的商用分子探针，如Alexa647、Atto740等，都在C=C碳碳双键区间显示了特征的预共振拉曼谱。

　　研究人员利用5种商用分子探针的预共振拉曼散射并结合3种荧光探针，实现了8种颜色的活细胞成像。为了进一步克服碳碳双键区间波段非常拥挤的缺点，他们创新地发明和发展了一系列含有炔基（碳碳三键）和氰基（碳氮三键）的分子探针。由于炔基和氰基的拉曼振动在无干扰的2000-2300 cm-1区间有单一的特征频率，且与生物体内常见基团有显著区别，该区间的拉曼探针可以比在拥挤的“指纹区”实现更多的“颜色”。研究人员结合了同位素标记和结构修饰等策略，合成了28种吸收在650-750 nm、三键振动频率在2000-2300 cm-1的新型预共振拉曼探针，并为他们取名为Manhattan Raman Scattering（MARS）调色板。

　　研究人员还通过神经细胞和大脑切片的成像，展示了预共振受激拉曼散射显微镜及其相应探针技术在生命科学研究中的潜力。

　　他们对小鼠海马体神经细胞进行了体外培养，并用免疫标记的方法标记了5种不同的标志蛋白，用两种正交的代谢标记对细胞内新合成的蛋白质进行脉冲-追踪实验，并用DNA染料确定细胞核的位置。通过对8种“颜色”的细胞图像进行交叉对比分析，研究人员观察到新生成的包涵体主要是由新合成的蛋白质构成。而星形胶质细胞中的内涵体远多于神经元细胞。他们认为这个实验支持了一个假说：星形胶质细胞可以将新合成的折叠错误的蛋白质隔离进入包涵体来减弱他们的毒性，然而神经元细胞没有这种能力，因此对蛋白质调控的错乱更加没有耐受性。

　　除此之外，闵玮研究组还开发了一种通用方法，可成像如小分子药物和核酸、氨基酸、脂类等广谱生物小分子，确定它们的定位以及在细胞内的功能机制。

　　当涉及到生物小分子时，荧光标记则存在问题，因为荧光团几乎总是大于目的小分子或是与目的小分子差不多大小。因此，它们往往会破坏这些发挥重要生物作用的小分子的正常功能。闵玮研究组放弃常规的荧光团荧光成像范式，转而追寻一种新型的物理和化学组合。具体说来，他们将一种称作为受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering, SRS)显微镜的新兴激光技术，与一种小型但非常有活力的炔烃标记（即C≡C，碳碳三键）相结合，C = C是一种化合物键，当其拉伸时，会以独特的“频率”（不同于细胞内的自然分子）发出强烈的拉曼散射信号。

　　采用这一小型的炔烃标记，这一新技术避免了采用更大荧光标记物造成的干扰，同时通过SRS成像获得了高检测特异性和灵敏度。通过将激光颜色调整至炔烃频率，并快速用聚焦激光光束逐点扫过样本，SRS显微镜可捕获小分子携带的C≡C键的独特拉伸运动，生成活细胞和动物体内分子的三维图像。以这种方式，闵玮研究小组证实可以追踪小鼠组织中带有炔烃的药物，以及显影通过在活细胞中代谢纳入炔烃标记的前体小分子重新合成的DNA、RNA、蛋白质、磷脂和甘油三酯。