牛津大学学者EMBO最新文章：ZRNA如何诱导细胞坏死

　　来自英国牛津大学weatherall分子医学研究所等处的研究人员发表了题为“Sensing of viral and endogenous RNA by ZBP1/DAI induces necroptosis”的文章，通过小鼠敲入模型，探索了Z-RNA神秘的功能之谜，指出ZBP1是一种RNA传感器，并且Z-RNA可能具有一种分子模式：通过ZBP1诱导炎症细胞死亡。这一研究成果公布在EMBO Journal杂志上。 令人不解的Z构象 核酸都能形成双螺旋结构，双螺旋有多种构象，双链DNA通常采用的是B构象，而双链RNA一般是A构象。此外DNA和RNA都能形成Z型双螺旋，这种双螺旋的特征在于左手螺旋排列，糖磷酸骨架呈锯齿状排列，外面只有一条沟（见下图）。

　　Z-DNA最早是1972年发现，此后在单晶X衍射分析中确定了这种模型，研究人员认为其生物学意义可能用于某些调节蛋白的识别，或者转录调控，至今尚不完全清楚其具体的生物学功能，而对于Z-RNA，科学家们更是不解。

　　早期生物化学和结构研究鉴定出了一种称为Z-绑定结构域（Z‐binding domain，ZBD）的蛋白质高级结构，能特异性结合Z-DNA，但不与B-DNA结。这个78个氨基酸长的氨基酸也被称为Zα或Zβ。随后的研究工作表明它不仅与Z-DNA结合，而且与Z-RNA结合。目前已在四种蛋白：ADAR1，ZBP1，E3L和PKZ中发现了ZBD，其中前两者是与抗病毒先天免疫应答有关的哺乳动物蛋白质。E3L是可以拮抗宿主反应的痘病毒蛋白。最后一种PKZ是与哺乳动物PKR相关的鱼蛋白，也参与抗病毒免疫。这表明ZBDs在先天抗病毒免疫应答中扮演了重要的角色，同时也指出Z-DNA和/或Z-RNA能诱导这种宿主防御反应。在进一步的系统性红斑狼疮患者血清研究中，研究人员也发现系统性红斑狼疮患者血清中含有抗Z-DNA自身抗体，也指向了免疫应答作用。 Z-DNA结合蛋白1（ZBP1，也称为DAI或DLM-1）具有两个N末端ZBD（Zα1和Zα2）和两个RIP同型相互作用基序（RHIM）。最初这种蛋白被认为是诱导I型干扰素（IFNs）的B-DNA传感器，但是ZBP1缺陷小鼠研究结果与其并不一致，无法证实这一假说。相反，ZBP1能激活NF-κB并触发细胞坏死性凋亡。

　　所谓坏死性凋亡（necroptosis）是近年来发现的一种新的细胞死亡形式，它在向细胞下达死亡指令的同时，刺激了一种炎症反应让免疫系统知道出现了一些问题。然而，当这一细胞死亡信号通路开始出现失控时，它可以导致炎症性疾病。坏死性凋亡还牵涉到神经退行性疾病、失血引起的脑损伤，以及某些病毒感染。坏死性凋亡主要是通过RN途径所调控，这一调控途径包含：受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）和RIPK3激酶相关作用形成坏死复合体(necrosome)，并且通过RIPK3所调控的磷酸化作用使MLKL活化，活化后的MLKL从细胞浆转移到细胞膜并使细胞膜完整性破坏，最终导致细胞坏死。

　　坏死性凋亡能通过清除病毒感染的细胞，从而参与宿主防御。研究发现病毒能抑制坏死性凋亡，此前一个重要的证据就是小鼠巨细胞病毒（MCMV）感染——MCMV通过表达M45，阻止ZBP1和RIPK3依赖性坏死性凋亡。M45结构上就有破坏ZBP1和RIPK3相互作用的RHIM基序。如果RHIM突变，那么这种MCMV就无法抑制坏死性凋亡，引发感染细胞的死亡。坏死性凋亡通常是通过caspase‐8的蛋白水解活性来进行检测，遗传缺失，或者caspase‐8化学阻断的细胞会对RIPK3依赖性坏死性凋亡提高敏感性。由此研究人员认为在M45-RHIM突变MCMV感染期间，病毒M36蛋白（也就是caspase‐8诱导细胞凋亡（vICA）的病毒抑制剂）能通过阻断caspase‐8发生坏死性凋亡。

　　揭开Z-RNA神秘的面纱 为了能解开Z构象的功能之谜，在最新这篇文章中，研究人员委托赛业生物采用TurboKnockout技术构建了携带四种特殊氨基酸的Zbpl-敲入小鼠，这些氨基酸能消除其与Z型核酸的结合。由此研究人员发现Zbp1‐突变小鼠中的细胞会对MCMV‐M45mutRHIM诱导坏死性凋亡产生抗性。在感染期间，抑制RNA转录，但不抑制病毒DNA复制，会阻断ZBP1依赖性坏死性凋亡，而且研究人员还发现ZBP1会与新合成的RNA结合。 此外，ZBP1能以RNase敏感的方式与内源性RNA和染色细胞交联。这些都说明了ZBP1是一种RNA传感器。

　　这也就是说，诱导细胞死亡是细胞自主发生的，这个过程需要的是RNA合成而不是病毒DNA复制。ZBP1通过其ZBD直接与RNA结合，坏死性凋亡需要完整的ZBP1-ZBD，由ZBP1和caspase阻断的异位表达。由此这项研究指出，Z-RNA可能构成了一种分子模式：通过ZBP1诱导炎症细胞死亡。

　　研究要点：

　　ZBP1/DAI是病毒RNA的传感器，在小鼠巨细胞病毒感染期间能启动细胞坏死性凋亡（necroptotic cell death）。当caspase‐8活性受损，ZBP1就会与内源性RNA结合并诱导坏死性凋亡。

　　1.ZBP1/ DAI是一种RNA传感器；

　　2.RNA识别是通过ZBP1的两个Z型-核酸结合结构域完成的，并能引发病毒感染细胞的坏死性凋亡；

　　3.携带zbp1突变的敲入小鼠（无法与Z-RNA结合）中的细胞不会出现病毒诱导坏死性凋亡；

　　4.ZBP1能与内源性RNAs相互作用，并在caspase‐8活性受损时引发坏死性凋亡。

　　附技术说明

　　技术原理：

　　基于ES打靶的TurboKnockout基因敲除技术采用了独特的建系和基因改造技术建立了具有高效遗传优势的ES细胞系，通过特定胚胎发育阶段的显微注射，使TetraOneTMES细胞100%代替内源ES细胞，从而实现跨越“嵌合体”阶段，把ES打靶构建周期短至6-8个月。并且TurboKnockout技术采用独特的Self-deleting Neo Cassette所获得的嵌合体与任何品系小鼠交配，都可100%自删除Neo。也就是说，TurboKnockout不仅仅实现跨越“嵌合体”阶段，还能真正自删除Neo从而快速获得去Neo的杂合子小鼠。

　　技术优势： TurboKnockout基因敲除建立在传统基因打靶技术之上，不仅具有传统ES打靶技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点，更是使得传统ES打靶技术减少两代繁育时间，制作周期缩短至仅需6个月。

　　从目前的基因编辑技术条件看，如果做完全性基因敲除、双基因敲除、点突变基因敲入和小鼠以外的基因改造，可以选择赛业生物经过特殊优化的CRISPR-Pro技术。但严谨性要求高的项目，例如小鼠的条件性基因敲除或大片段基因敲入，推荐选择TurboKnockout基因敲除技术。基于ES打靶的TurboKnockout基因敲除技术仍是更快、更精准、更可靠地改造小鼠基因的金标准。