基因测序技术大升级

  DNA就像是漆黑的夜里萤火虫发的光，第二代测序技术无法辨别每一只萤火虫，所以就把上千只萤火虫放在同一个袋子里，才能收集到它们的光。但第三代技术却可以辨别每一只萤火虫，而且可以同时测量很多个DNA片断。

日前，南方科技大学生物系副教授贺建奎与另外几名中美科学家联合在生物医学杂志BioRxiv上发表论文，展示了使用深圳瀚海基因GenoCare第三代单分子荧光测序仪完成的大肠杆菌基因组测序结果，准确率达到99.7%。

这是第三代基因测序中准确率最高的。贺建奎在接受《中国科学报》记者采访时自豪地说。

基因测序技术的前世今生

单分子荧光测序技术被誉为第三代基因测序技术。若要明白其高明之处，不妨先了解一下前两代基因测序技术。

基因是生物体内一道道蕴含机密的密码，蕴藏了生物绝大部分遗传信息，人类自发现了基因就无一日不想破解它的秘密。基因测序就是要测定未知的序列，确定重组基因的方向与结构，对突变进行定位和鉴定比较的研究。

第一代基因测序技术诞生于1977 年，是由美国生物化学家A.M.Maxam和W.Gilbert发明的化学降解法。这种方法仅从化学领域触发，科学家将一个DNA 片段的5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的DNA片段。然后再通过凝胶电泳分离，经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的基因的碱基序列。

同年，英国生物化学家Frederick Sanger发明了双脱氧末端终止法，即至今广泛应用的Sanger测序法。应用这一技术，科学家完成了首次的人类全基因的测序工作。Sanger测序法是用双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。以该法为基础，Sanger后来对它进行了许多改进，使之更适合实际操作，为后来的大规模测序提供了技术支持，其中一个重要改进是利用单链DNA噬菌体载体将随机打断的DNA片断分别测序，再拼成完整的基因。

上世纪90年代初出现的荧光自动测序技术逐步代替了双脱氧末端终止法，并且将DNA测序带入自动化测序时代。

第二代测序技术较之第一代，进步主要体现在高通量与低成本上。第一代测序技术一次只能测一个基因，第二代测序技术则一次可以测量几万个基因。贺建奎解释说。2012年11月，大型国际科研合作项目千人基因组计划的研究人员发布了1092个人的基因组数据。参与这一项目的科学家用第二代测序技术完成了对世界上主要人群的基因组测序工作，绘制了迄今为止最详尽、最有医学应用价值的人类基因组遗传多态性图谱。然而，读长相对较短仍是第二代测序技术的主要瓶颈。

为了突破这一瓶颈，科学家们继续探索，终于发现了单分子的测序技术。这一技术也被称为第三代测序技术。与前两代不同的是，它基于单分子水平的边合成边测序。贺建奎解释说，第三代的单分子荧光技术多条基因并行的测序方法与第二代相同，但第三代实现了单分子纳米级别的测量。打个比方，DNA就像是漆黑的夜里萤火虫发的光，第二代测序技术无法辨别每一只萤火虫，所以就把上千只萤火虫放在同一个袋子里，才能收集到它们的光。但第三代技术却可以辨别每一只萤火虫，而且可以同时测量很多个DNA片断。

节约时间和金钱

第三代测序技术真正实现了对每一条DNA分子的单独测序，有着更快的数据读取速度，应用潜能也势必超越先前的测序技术。第三代测序技术包括单分子荧光测序技术、单分子实时测序技术和纳米孔测序技术。

单分子荧光测序技术与贺建奎有着千丝万缕的联系，我导师的导师朱棣文，是单分子光学检测的鼻祖，1997年诺贝尔奖得主。我们将先进的光学技术用到了测序工作中。”贺建奎介绍道。

更重要的是，因为单分子级别的分辨率极高，省略了以往测序工作中聚合酶链式反应（PCR）的步骤。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，就像放大镜。但放大DNA也需要时间，省略这一步骤意味着时间的节约。

第三代测序技术最大的优势还是在于时间与金钱的节约。”贺建奎介绍道。第一代DNA测序技术2001年完成首个人类基因组图谱，耗时3年，花费数十亿美元；二代测序技术将一个人基因组测序的时间和费用降为1周以内和1000美元；而他们的三代测序仪可在24小时内完成这一工作，在大规模量产后，有望在三年内将费用降至100美元。

在使用时，人们只需要提供唾液、毛发、血液等含有生命物质的物品，放入试剂盒，即可以看到结果。贺建奎说，而且，测序之前的样品制备不需要单独准备，而是由这台测试仪一并解决。

更令贺建奎骄傲的是，深圳瀚海基因GenoCare第三代单分子荧光测序仪的成功问世，源于各个领域的合作。“这些领域包括精密机械、先进光学、纳米材料、分析化学、分子生物学，甚至还有流体力学以及软件工程。贺建奎感慨道，这需要多个学科共同努力、深度交叉，甚至在以后也要依靠各个学科共同推进，才能有测序仪新的突破。

走向临床应用

贺建奎与同事们研发的深圳瀚海基因GenoCare第三代单分子荧光测序仪，虽不是首个技术应用，但它却是站在巨人的肩膀之上，向着临床应用的方向不断前进。

与另一家公司美国螺旋生物（Helicos）当年生产的第三代单分子荧光测序仪相比，瀚海基因样机的尺寸只有其1/4大小，单台造价仅为Helicos测序仪当年造价的1/6，并且瀚海基因成功实现了所有化学试剂消耗品的国产化。而且，我们的基因测序仪不再需要PCR仪、凝胶成像仪、荧光定量PCR等多个辅助仪器，而是全部集成在一台机器中。贺建奎说，更重要的是，在全球第三代测序仪中，南科大研发的GenoCare基因测序仪通量和准确度两个方面都达到世界领先。在30x测序深度下其准确率达99.9%。