更快更灵敏的timsTOFPro：为蛋白质组学而生

　　分析测试百科网讯，今年9月国际人类蛋白质组学大会（HUPO）上，布鲁克公司发布timsTOF Pro捕集离子淌度飞行时间质谱，该产品获得了由分析测试百科网组织评选的2017 ANTOP大奖，奖项名称为“蛋白质组学创新质谱技术奖” 。BCEIA展会上，分析测试百科网编辑采访到布鲁克道尔顿中国区高级商业总监王克非博士，他将为我们详解timsTOF Pro的创新。这是布鲁克继去年ASMS推出震撼的timsTOF离子淌度飞行时间质谱后，推出的第二款创新离子淌度质谱产品；也是迄今为止专用于蛋白质组学的离子淌度质谱产品。希望通过本文，为从事蛋白质组学研究的质谱实验室带来新的启发和新的强有力的工具。

布鲁克道尔顿中国区高级商业总监 王克非 博士

　　谈到timsTOF Pro新产品的意义，王克非博士首先表示，这是布鲁克近5年推出的最重要的新产品之一。这里的Pro不是升级换代的意义，而是指蛋白质组学（Proteomics）。该产品目前主要为shotgun鸟枪法蛋白质组学服务，其中的一些功能未来也可用于代谢组学，目前主要应用于bottom-up proteomics（自下而上的蛋白质组学）。

timsTOF Pro的特点和优势

timsTOF Pro捕集离子淌度飞行时间质谱

　　该产品为蛋白质组学用户带来的重要好处是：更快，更灵敏，鉴定出更多的蛋白。

更快的高分辨MS/MS

　　timsTOF Pro捕集离子淌度飞行时间质谱通过离子淌度（ion mobility）分离后，利用四极杆进行快速扫描，再送入碰撞室CID碰撞后，到TOF中进行高分辨的MS/MS测定。在整个LC-MS/MS流程中，每秒可以获得100-150张高分辨的MS/MS谱，且可保持40,000-50,000高的分辨率，达到业界最高的水平。关于这一点，小编还追问了王克非博士，采集MS/MS图谱时，比较所有其它质谱，Q-TOF是唯一可以获得20,000-50,000的高分辨MS/MS的质谱类型（Orbitrap在做shotgun蛋白质实验室，其MS/MS图谱通常只有7,500的分辨率），而timsTOF Pro不仅可以达到40,000-50,000的MS/MS分辨率，而且可以达到业界最快的每秒100-150次MS/MS的采集速度（Orbitrap的最快MS/MS速度为每秒40次MS/MS）。

更灵敏

　　由于timsTOF Pro有更快的采集速度，在有些情况下，有些离子可以扫描多次，从而累积离子，获得更高的灵敏度，若以平均每个母离子扫描3次计，这就使得灵敏度提高了3倍。为用户带来的好处是：首先可以鉴定到更低丰度的蛋白，其次可以使用更少的样品。

鉴定出更多的蛋白质

　　更快、更灵敏，在鸟枪法蛋白质组学中，最终带来的结果是，可以在一次实验中，鉴定更多的蛋白质。比如，在200ng HeLa Digest（人宫颈癌细胞酶解物）样品中，可以通过90分钟的LC-MS实验，鉴定5,200多个蛋白质，达到业界最高的水平。

timsTOF Pro的工作原理：双TIMS和PASEF

　　离子淌度为LC-MS增加了除了液相保留时间、m/z外的新维度的分离，主要根据分子的形状进行分离，为复杂体系样品的测定带来了巨大的想象力。但在蛋白质组学这种超复杂的体系测定中，淌度分离的时间一般为30-100毫秒，那么这段时间内的淌度分离时间就不再能接受LC流出的样品，因此就造成了样品的丢失，离子利用率大打折扣。

　　timsTOF Pro创新性地使用了双TIMS分离/富集装置，离子在第一个TIMS部分中进行累积，然后在第二个TIMS中根据淌度进行分离，经过分离后的离子继续用于MS/MS碎裂。随后重复该步骤，在该过程中，当第二个TIMS进行分离时，第一个TIMS也同时在平行地累积离子，这样可以实现近乎100％的离子利用率。使用这种PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation平行累积串行碎裂）技术[1]，可以为纳升LCMS分析酶解蛋白质混合物的工作提供优异的稳定性。

timsTOF Pro的双TIMS，同步的四极杆质量过滤器，高速碰撞池，高分辨UHR-TOF

　　 PASEF技术代表了一种革命性的创新，为鸟枪法蛋白质组学提供了更高的灵敏度和更快的速度，并且不损失质量分辨率。在鸟枪法蛋白质组中经常使用的基于傅立叶变换的质谱，存在扫描速度有限以及提高扫描速度时会降低质谱分辨率的问题。而现在PASEF技术解决了这个问题，凭借近100％的离子利用率，可以在母离子和子离子扫描过程中，在保持质谱超高分辨率的同时获得更高的灵敏度。这种PASEF技术使timsTOF Pro成为科学家们的得力工具。可帮助他们对复杂样品的分子机制进行更深入的研究、提高发现低丰度生物学重要蛋白质的可能性；在转化医学、临床蛋白质组学研究中进行大批量验证和纵向研究。

　　定量蛋白质组学是蛋白质组学研究的一个关键领域。与传统的基于门控技术、时间串联技术和傅立叶变换技术的质谱相比，双TIMS-powered的PASEF技术具备显著的优势。新的timsTOF Pro在低上样量（100-200ng）的情况下超过四个数量级的动态范围。使其适用于小细胞群体的蛋白质组学和生物研究和临床研究中经常遇到的低丰度样品。

　　德国 Max Planck Institute of Biochemistry的蛋白质组学和信号转导系主任Matthias Mann 说：“我的实验室与布鲁克合作开发PASEF技术，我们很高兴看到timsTOF Pro实现了我们最初设想的鸟枪法蛋白质组学的潜力。这种新技术有可能革新蛋白质组学的几个领域：在需要运行大批量样品中确保速度和稳定性的临床研究；需要增加灵敏度的应用，例如磷酸化多肽的富集实验或数量有限的待分析细胞；使用同位素标签的定量实验，由于附加的离子淌度至少能部分去除由共洗脱峰带来的污染物，从而避免了由污染物带来的同位素抑制效应和由此产生的误差。我们同时也对该技术进一步发展的潜力感到非常兴奋。”王克非博士表示，timsTOF Pro正是和Matthias Mann教授合作的杰出成果。

PASEF 周期：通过将四极杆与 TIMS 离子逐出时间同步, 在100毫秒内平均可碎裂12个母离子（相当于每秒采集>100张MS/MS），智能软件可针对低丰度母离子进行多次PASEF MS/MS碎裂

　　王克非博士也谈到了timsTOF Pro和布鲁克2016年推出的timsTOF的区别，主要有三点：（1）timsTOF只有一个TIMS离子漏斗，而timsTOF Pro有两个TIMS漏斗；（2）在采集方式和工作流Workflow上，timsTOF Pro专门为蛋白质组学做了优化；（3）timsTOF可以精细调节离子淌度分辨率，最高可达到200，更适应于研究小分子或其它需要精细研究的领域，而timsTOF Pro的淌度分辨率固定在40-50，专门为高复杂度的鸟枪法蛋白质组学设计。

离子淌度未来的发展空间

　　离子淌度是上世纪60年代提出的技术，迄今已有很多商品化仪器，包括独立的离子迁移谱，用于质谱前端提高信噪比的离子淌度装置，以及离子淌度Q-TOF质谱。谈到离子淌度的未来，王克非博士谈到本届BCEIA学术会议上大家讨论的热点。离子淌度已经被证实可以成功地实现分离，除此之外，离子淌度Q-TOF质谱在获得淌度分离的同时，还获得了气态离子的CCS（碰撞截面积），那么，这个CCS是否能解释分子的化学结构，和NMR，XRD等仪器获得溶液中分子的结构数据如何进行比较和阐释？报告的有些演讲者谈到，他们已经开始做这方面的探索，还需要同其它擅长如NMR、XRD的分析工作者结合起来开展研究。

战略：进一步走向高端和科研 助力客户取得Nobel奖级的成就

　　从自身业务来看，近几年布鲁克道尔顿中国的销售都位于全球第二，仅次于美国。从用户需求上，王克非博士谈到，越来越多的客户，尤其是一些重点高校、研究单位的实验室，越来越愿意购买高端的质谱，购买那些具有独特特点的质谱来开展研究工作；另一方面，质谱也在走向临床诊断领域。布鲁克原来在此方面有几种类型的高端质谱：（1）MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF，做蛋白和大分子的分析；（2）MALDI-TOF在精准医疗中进行快速诊断检测，如微生物鉴定质谱；（3）质谱成像。今年Nobel生理学奖获得者之一Michael Rosbash，曾在2013年Molecular Brain上发表论文，用布鲁克的MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF来研究神经肽组[2]。

　　随着timsTOF Pro的推出以及布鲁克对市场的观察，布鲁克的销售方向也将从应用市场更加转移到高端科研级市场，面向更多高端客户、科研客户。这样的产品还包括：timsTOF Pro/timsTOF，rapifleX，FTICR MS。在石油化工中极复杂样品的分析、小分子的代谢组学，Top-down蛋白质组学，FTICR MS仍然具有无与伦比的优势，中科院大连化学物理研究所不久前即安装验收了最高端的15特斯拉的FTICR MALDI MS；再比如广东工业大学，香港浸会大会，山东分析中心等客户都采购了rapifleX MALDI-TOF 开展质谱成像研究。王克非博士表示：“在精准医疗的微生物鉴定质谱领域，布鲁克的销售基数大，增长也比较稳定；未来更大的突破将在科研领域。这要求我们从团队建设方面进行优化，对营销和技术支持人员的能力与知识结构提出更高的要求，从而更好地服务于高端科研客户。”

　　参考文献：

　　[1] J.Proteome Res. 2015,14,5378-5387, Parallel Accumulation – Serial Fragmentation (PASEF): Multiplying Sequencing Speed and Sensitivity by Synchronized Scans in a Trapped Ion Mobility Device

　　Florian Meier, Scarlet Beck, Niklas Grassl, Markus Lubeck, Melvin A. Park, Oliver Raether, and Matthias Mann

　　[2] Molecular Brain2013, 6:60，A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics

　　Joseph P Salisbury†, Kristin J Boggio†, Yun-Wei A Hsu, Jeniffer Quijada, Anna Sivachenko, Gabriele Gloeckner, Paul J Kowalski, Michael L Easterling, Michael Rosbash and Jeffrey N Agar