【原理】
植物体内的可溶性糖主要指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在10~100μg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在485nm波长下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,基本不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定160min以上。
【仪器 与用具】
分光光度计;电炉;铝锅;20ml刻度试管;刻度吸管5ml 1支,1ml 2支;记号笔;吸水纸适量。
【试剂 】
1.90%苯酚溶液 称取90g苯酚(AR),加蒸馏水10ml溶解,在室温下可保存数月;
2.9%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液,加蒸馏水至30ml,现配现用;
3.浓硫酸(比重1.84);
4.1%蔗糖标准液 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重,精确称取1.000g。加少量水溶解,移入100ml容量瓶中,加入0.5ml浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度;
5.100μg/ml蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中,加水定容。
【方法】
1.标准曲线的制作
取20ml刻度试管 11支,从0~10分别编号,按表24-1加入溶液和水。
表24-1 各试管 加溶液和水的量
管 号 | 0 | 1~2 | 3~4 | 5~6 | 7~8 | 9~10 |
100μg/ml蔗糖液(ml) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
水(ml) | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 |
蔗糖量(μg) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液,摇匀,再从管液正面快速加入5ml浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8ml,在恒温下放置30min,显色。然后以空白为参比,在485nm波长下比色测定,以糖含量为横坐标,光密为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程。
2.可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取0.10~0.30g,共3份,或干材料。分别放入3支刻度试管中,加入5~10ml蒸馏 水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25ml容量瓶中,反复冲洗试管及残渣,定容至刻度。
3.测定 吸取0.5ml样品液于试管中(重复2次),加蒸馏 水1.5ml,同制作标准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚,浓硫酸溶液,显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量,按下式计算测试样品中糖含量。
可溶性糖含量(mg/g)= [C×(V/a)×n]/(W×103 )
式中 C-标准方程求得糖量(μg);
a-吸取样品液体积(ml);
V-提取液量(ml);
n -稀释倍数;
W-组织重量(g)。
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