见所未见：OptiMS拓展您的质谱潜能

　　——贝克曼库尔特公司在2011大连色谱会推出CESI 8000

　　【导语】在各种omics、系统生物学成为寻找新一代治疗药物的基本研究思路后，质谱被推上了历史的舞台。在这类研究中，以纳升/分钟（nL/min）的流速和质谱高效地联用是关键。若干年前，CE-MS被nanoLC-MS技术抛在了后面，因为CE鞘液的稀释导致其连接的质谱屈尊降到了让人难以接受的、紫外的灵敏度。作为毛细管电泳技术的先驱，贝克曼库尔特卧薪尝胆、历经5年推出了无需鞘液的OptiMS技术，今日在大连色谱会上隆重推出了应用OptiMS的CESI 8000毛细管电泳，并列举了在CE-MS联用上，令人难以置信的1000倍以上的灵敏度提升、蛋白鉴定的高覆盖率、鉴定翻译后修饰的超高能力。

　　接下来，小编带您一起来了解这些科学家的工作吧；他们的工作，是最好的证明！

　　2011年10月10日，贝克曼库尔特公司无鞘液毛细管电泳质谱联用系统CESI 8000产品发布会在大连世界博览广场第五会议室隆重召开。来自国内外色谱、质谱等分离分析领域的100余专家学者们参加了此次发布会。来自奥地利Innsbruck医学院生物中心临床生物化学部的Herbert Lindner教授做了精彩的报告，详细比较了贝克曼新型CESI-MS和nanoLC-ESI-MS在鉴定多肽方面的性能。Lindner的同事Bettina Sarg博士介绍了用新型CESI-MS分析鉴定蛋白翻译后修饰位点的成果。

发布会现场

新型CESI 8000毛细管电泳

技术回顾：无鞘液的OptiMS

　　作为毛细管电泳技术的先驱，贝克曼库尔特公司潜心5年研发了新型的CESI 8000毛细管电泳仪，特别适用于蛋白质组学研究中的CE-MS分离分析。它采用无鞘液式CE-MS联接技术，将分离毛细管的出口部分腐蚀成多孔材料，多孔材料的外面由导电液体所包裹，导电液体与毛细管出口处的电极接触，为毛细管电泳的正常分离提供电压，也同时提供质谱离子化电压的加载。 由于该项技术的采用，使得CE-MS灵敏度提高1000倍以上，并超过现有LC-MS灵敏度1-2个数量级，是目前灵敏度最高的CE-MS系统。同时此项创新技术能够很好地解决LC-MS技术对高极性物质分离效果不佳的问题。

传统鞘液设计的CE-MS接口

新型OptiMS接口

更多阅读：五年研发结晶 最优化的毛细管电泳-质谱联用系统　　

CESI-MS vs nanoLC-MS技术：鉴定组学中的多肽

奥地利Innsbruck医学院生物中心临床生物化学部的Herbert Lindner教授

　　题目：CESI-MS，a New Technology for the Identification of Peptides: Comparison with nanoLC-ESI-MS

Linder教授报告

　　Lindner教授介绍了CE-MS用于蛋白质组学研究的挑战。相比基于色谱柱分离的nanoLC-MS技术，CE-MS有以下优点：（1）更高的效率；（2）更低的流速，可能具有更高的灵敏度；（3）没有梯度效应；（4）不需要柱平衡时间，即分析时间可能更短；（5）较少的交叉污染（carryover），即不需要考虑洗针，分析时间可能更短；（6）和HPLC有不同的分离机理，依赖于电荷而不是憎水性；（7）使用和HPLC不同的仪器系统，不需要换泵。同时，CE-MS潜在会有以下缺点：（1）载样量有限；（2）涂层的稳定性；（3）需考虑涂层和分析物的反应；（4）堵塞。

　　所以，CE-MS系统的耐用性（robustness）非常重要。

　　Lindner教授介绍了自己在前几年用毛细管区带电泳（CZE）对大鼠睾丸的天然H1组蛋白（histone）进行分析的结果。

　　接下来，他主要对比了新型CE-MS和LC-MS的结果。使用的样品包括：血管紧张素Angiotensin1和2的多肽标准品；大鼠睾丸连接器组蛋白（Rat Testis Linker Histones）；人类肿瘤细胞中的连接器组蛋白；过乙酰化核心组蛋白（Hyperacetylated Core Histones），用Arg-C酶解，比较新型CE-MS和LC-MS的结果（LC-MS采用nanoLC）。

OptiMS Silica Surface Capillary Cartridge

　　首先，用甲酸作BGE分析了血管紧张素Angiotensin 1和2的多肽标准品，条件为：样品浓度75fmol/uL，样品总量300amol，进样4uL，BGE为0.1％甲酸pH2.7，涂层为polyethyleneimine silane，E=250V/cm，ESI电压为1.7kV。结果的灵敏度S/N分别为：Ang-1 ：203，Ang-2：94。然后其余条件不变，改变进样量为0.18~0.75 nL，即样品总量为14~57 amol，在最低的0.18nL进样量下，提取离子流图（XIC）仍可获得很好的灵敏度，Ang-1：13.9 amol, S/N=84.8，Ang-2：17.2 amol，S/N=34.3。

　　然后，在比较了多种毛细管涂层后，选择了M7C4l。其中CE-MS的实验条件为：进样7.7nL，样品总量为300fmol， BGE为0.1％甲酸pH2.7，涂层为M7C4l，E=250V/cm，ESI电压为1.7kV。

　　比较CESI-MS（300fmol样品）、LC-MS（300fmol）、LC-MS（3.0 pmol）水平的样品检测结果，CESI-MS的出峰时间较快，12.83min即出完，而nanoLC-MS需要46.03min，但CE-MS的分辨率却非常好。从鉴定的多肽数目来看，CE-MS鉴定了135个H1组蛋白肽，48个非组蛋白肽，而LC-MS（300fmol）的相应两个数字是：79个/30个，LC-MS（3.0 pmol）为129个/74个，可看到CE-MS的灵敏度明显高（基本相当于3.0 pmol的LC-MS结果，即灵敏度比LC-MS高10倍）。在对7种组蛋白的鉴定序列覆盖率的比较中，也看出CE-MS的结果要明显优于LC-MS。

三种不同条件下的CE-和LC-MS分析

　　从H1组蛋白肽的鉴定上来看，CE-MS（300fmol）比较LC-MS（3pmol），两者共同鉴定的是78个，仅有CE-MS鉴定的是57个，仅有LC-MS鉴定的是51个。事实说明，CE-MS不仅提高了灵敏度，而且成为LC-MS鉴定的有力补充，使用两种技术后，鉴定的数目从129个增加到了186个（51＋78＋57）。

　　

被鉴定出的肽（300 fmol CE-ESI-MS和3.0 pmol LC-ESI-MS）

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　　接下来，Lindner教授考察了对修饰后的肽的鉴定。 其中LC-MS条件为：进样770 nL，样品总量为300 pmol。CE-MS的实验条件为：进样7.7nL，样品总量为300 fmol， BGE为0.1％甲酸pH2.7，涂层为M7C4l，分离电压为25kV，E=267V/cm，ESI电压为1.7kV。同样可看到CE- MS（300fmol）的鉴定数目几乎相当于LC-MS（30pmol）的，即灵敏度比LC-MS高接近100倍；在修饰鉴定的种类上，CE-MS会少一 些。

两种技术对比：鉴定翻译后修饰的多肽

      Lindner教授认为，CE-MS的分离时间很短，囿于质谱的采集速度，要想获得更多的鉴定结果，需要拓宽分离的窗口，即降低EOF。这时可采用：使用 较少正电荷的涂层，减低分离电压，提高离子强度等方法。Lindner教授比较了几种结果，CE-MS（M7C4l涂层，12.5kV分离电压）获得了非常好的结果。

两种技术对比：鉴定翻译后修饰的多肽

用CESI-MS和LC-MS，共计发现了56个翻译后修饰的多肽，实验条件为：

CESI-MS，进样7.7 nL，样品量300 fmol，毛细管涂层为M7C4l，分离电压为12.5 kV，3次总运行时间为1.9小时（115 min）

LC-ESI-MS，进样770 nL，样品量30 pmol，3次总运行时间为4.1小时（246 min）

总结：翻译后修饰的鉴定

　　最后，对比贝克曼新型CE-MS和传统nanoLC-MS技术，Lindner教授给予了总结，

　　（1）在同样的样品量下，CE-MS有更高的灵敏度、更高的序列覆盖率；

　　（2）使用CE-MS，可提高低分子量肽（800－1200 Da）的检出；

　　（3）CE-MS技术一般可缩短分析时间，该时间可通过使用不同的毛细管涂层、分离电压和缓冲液来调节；

　　（4）CE-MS非常适用于分析翻译后修饰的多肽；

　　（5）CE-MS具有非常明显的一个优势是——极低的交叉污染；

　　（6）这是一个耐用性（robustness）很好的技术。

　　（7）CESI-MS和LC-ESI-MS技术是互补的。

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鉴定翻译后修饰的位点

　　奥地利Innsbruck医学院生物中心临床生物化学部的Bettina Sarg博士

　　题目：Application of CESI-MS for the Analysis of Site-specific Protein Modifications

　 　Bettina Sarg博士进一步介绍了用新型CESI-MS，在翻译后修饰鉴定方面的结果。Sarg博士首先介绍了翻译后修饰的作用。翻译后修饰会改变蛋白的物理化学 性质，比如折叠、稳定性、活性和功能等。对于组蛋白的研究发现，有一些压制性的修饰和一些活性的修饰，这些跟DNA结合的蛋白（如转录因子）有关。随 后，Sarg博士进行了翻译后修饰的实验，样品包括：来源于肿瘤细胞的过乙酰化（Hyperacetylated）的组蛋白H4，大鼠睾丸核心组蛋白，大 鼠睾丸连接器组蛋白，火鸡鸡胗的钙调结合蛋白（Turkey Gizzard Caldesmon）。比较的仪器为：（1）CESI-MS：PA800plus-LTQ-Orbitrap XL（目前的CESI 8000是PA800plus的升级新产品）；（2）nanoLC-ESI-MS：Ultimate3000 -LTQ-Orbitrap XL。

　 　在对来源于肿瘤细胞的过乙酰化（Hyperacetylated）的组蛋白H4的分析中，用CESI-MS分析了天然蛋白，操作条件为：毛细管 30um ID, 88-100 cm，正电荷涂层M7C4l，BGE用0.1%甲酸，导电液体为0.1%甲酸，分离电压为25kV，喷雾电压为1.55kV，毛细管温度为25℃，分离电 流为1.3 uA。

　　对大鼠睾丸核心组蛋白，用CESI-MS分析翻译后修饰的多肽。实验用CESI-MS鉴定了H2A和H2B翻译后修饰的位点，并均具有高的序列覆盖率（H2A为90.0%，H2B为88.9%）。

　 　Sarg博士还使用了IMAC磷酸化蛋白富集技术，对比使用CESI-MS和LC-MS的结果，其中CESI-MS的实验条件为，进样量8.5 nL，BGE用0.1%甲酸pH2.7，毛细管涂层用M7C4l，E=250 V/cm，ESI喷雾电压为1.7 kV。随后又把分离电压从25 kV改变到12.5 kV，可以鉴定出更多的磷酸化肽。使用IMAC磷酸化富集技术后，用CESI-MS和LC-ESI-MS共同鉴定的磷酸化肽为14个，仅用CESI-MS 鉴定出的有23个，仅用LC-ESI-MS鉴定出的为18个，两种技术共鉴定出55个。

CE-MS和LC-MS鉴定翻译后修饰位点的对比，CE-MS更容易鉴定小分子量的多肽

磷酸化肽的鉴定结果

　 　在对火鸡鸡胗的钙调结合蛋白（Turkey Gizzard Caldesmon）的分析中，也使用IMAC磷酸化肽富集技术，使用LysC酶解钙调结合蛋白，用IMAC富集后，分别使用CESI-MS和LC- ESI-MS分离分析。结果表明，CESI-MS的灵敏度大概相当于LC-ESI-MS的40倍。而对于7个鉴定的磷酸化位点，当使用同样的进样量 时，CESI-MS和LC-ESI-MS同时可鉴定出第1、3种，CESI-MS单独鉴定出第4、5、6种，而LC-ESI-MS没有单独鉴定出的位点； 当使用40倍上样量后，LC-ESI-MS可单独鉴定出第2种，两种技术可同时鉴定出第1、3、5、6种，CESI-MS可单独鉴定出第4种。

火鸡鸡胗的钙调结合蛋白（Turkey Gizzard Caldesmon）的分析中，磷酸化肽鉴定结果对比

　 　总结来看，CESI技术非常适于分析翻译后修饰（PTM）的多肽，并对PTM具有快速筛查的能力，对于分子量较小的肽来说，CESI技术提高了回收率， 因为这类小肽在反相柱上难以保留，利用CESI-MS技术，实验鉴定了组蛋白H2A和钙调结合蛋白的修饰位点，利用IMAC技术富集后，可更好地检测磷酸 化肽。

       发布会当日座无虚席，听众还咨询了Lindner教授问题。Beckman公司会后进行了抽奖活动。

OptiMS技术：优化您的质谱性能

      新型无鞘液的CESI-MS技术，对所有关注组学的研究者来说，是nanoLC-MS技术的有力补充：灵敏度高；发挥了低流速的优势、减少了离子抑制；可 鉴定更多小分子量的多肽。除举例的多肽混合物分析，该技术还非常适用于天然蛋白、代谢组学、药物和代谢产物等分析。

OptiMS可更换的组件：一套

      新发布的CESI 8000，其CE-MS接口是成套的、可更换的装置，据公司称可使用数百次。根据多个质谱厂家，公司提供不同的接口，这些厂家包括：AB SCIEX、Thermo Scientific、Bruker Daltonics和Waters。

      更多应用，小编也和读者一样，期待这种新技术能真正让Beckman重回组学市场，来个咸鱼大翻身！......