Cell:长期被误解非编码RNA存在“认知黑洞”

　　 在人类基因组中95%的基因并不编码蛋白质，其他物种也有大量的非编码基因。这些DNA不会被编码成蛋白质，却又会转录出非编码RNA，它们对生命活动起什么作用？是进化的冗余还是神秘的缓存？

　　《细胞》杂志近日刊登中国工程院院士曹雪涛团队的研究论文，他们发现一种全新非编码RNA分子。该分子能够调控免疫系统的“进”与“退”，这是此前学术界从未认识和证明的。“由于长链非编码RNA（lncRNA）丰度低，业界对其功能争议很大。”浙江大学生命科学研究院教授徐平龙在此前接受采访时评价道，但此次发表的研究严谨地鉴定了所发现的一种全新lncRNA是有功能的，即能够进行免疫调控，而曹雪涛院士正是这一机制的主要开拓者之一。大海捞针 从浩淼细胞中层层筛选而出细胞虽小，却瀚如乾坤。寻找一个不知道存不存在的RNA分子，如大海捞针。

　　到哪里找线索？病毒感染给了曹雪涛启示。谈到为什么会从病毒这个“敌人”的角度考虑。曹雪涛讲道：“我们中国文化讲，阴中有阳、阳中有阴，这是外国人很难理解的。这一哲理指导我们对免疫系统的理解就是，激活和抑制很可能会交融在一处，那么我们就从这个‘交融点’突破解题。”既然体内蛋白能够识别外来的病毒RNA，能不能识别体内自身RNA呢？

　　科学界大部分认为不能。“免疫系统拥有识别‘自我’‘非我’的能力，就好像边境卫士，对外来的侵害反应敏感，对辖内‘居民’熟视无睹。”曹雪涛院士团队成员之一、中国医学科学院基础医学研究所教授姜明红说，“但是曹老师并不这么看，他说，究竟是不是熟视无睹，你要证明才行。”

　　在中国传统哲理思想的指引下，曹雪涛锁定了一个已知的关键蛋白——“RIG-I”，求证这个能与病毒RNA结合的蛋白，会不会和体内自身的RNA分子结合。

　　RIG-I很像一个分子水平的“老鼠夹子”，2011年有科学家解析了这个蛋白的分子结构，发现“老鼠（病毒RNA）”没来的时候，夹子合着，两头的结构域相互作用，蛋白处于“闭合”状态；一旦“老鼠”来了，与夹子的一头结合，另一头就会“弹开”，蛋白遂处于激活状态。而这样的构象变化，会引发细胞合成出关键的抗病毒分子——干扰素，干扰素分泌后被周围细胞接受，引发抗病毒的“连锁反应”。

　　研究团队通过紫外加强RNA结合蛋白免疫沉淀（UV-RIP）的方法，将“老鼠夹子”和它猎捕的“老鼠”同时从细胞中分离出来。随后通过蛋白质变性等方法，把“老鼠夹子”过滤掉，就获得与RIG-I结合的所有RNA。

　　夹子“钓”上来的所有RNA中，有没有未被发现的有功能的lncRNA呢？

　　将“捞针”的范围锁定夹子“钓”上来的RNA后，团队又通过设计对应的干扰实验继续缩小范围，即看究竟哪个RNA被封杀之后，免疫活动不再被抑制。功能筛选帮助团队锁定了一批备选者并列出“排名”。排名靠前的RNA分子，且与特定信号通路相关的lnc-Lsm3b被锁定，一个新的RNA分子从浩淼的小鼠巨噬细胞中经过层层筛选被“打捞”上来，并获得了确切的序列。

　　团队后续开展了多角度的证明工作，如通过干扰、敲除、过度表达等技术，反复证明lnc-Lsm3b能够在病毒感染的细胞中，通过“分子诱饵”的方式锁定RIG-I，使其不与病毒RNA结合。

　　海量实验 顶级期刊的尖锐难题被逐个攻克

　　全新的发现，使得团队兴奋异常。没想到的是，更大的磨砺还在后面。

　　团队向顶级期刊投稿，审稿人却要求必须用CLIP（交叉互连免疫沉淀）技术明确RNA的哪一个点和蛋白质相互作用，连接在一起。用语言很难解释蛋白质和RNA在活体细胞内错综复杂的关联，姜明红给科技日报记者画图：一个长链RNA会结合多个蛋白，这些蛋白有的是特异连接，连得紧密，有的就是“挂”在上面，而蛋白之外还会带上其他的RNA，“缠绕”“连带”“虚实”……

　　CLIP很难做，国内实验室极少有成熟的经验。收到修改意见后的团队成员开始大量查阅论文。“国外的实验流程无法完全照搬，不同的细胞做法不同，需要重新摸条件。”团队中主要攻关这一技术的刘伦说。

　　CLIP技术和RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）技术类似，但是却能够达到单个碱基的分辨率。为此，通过海量实验，针对裂解液的成分如何影响细胞内物质，团队开始了如指掌；不同RNA酶的脾气也熟练掌握。

　　实验室的部分我们自己攻克了，但是测序公司表示无法进行匹配的测序工作，原因是无法合成特有的适当引物。”刘伦说，国内没有公司生产CLIP所需引物，而RNA测序必须先反转录为cDNA才能够进行，引物决定了反转录的准确性，决定了目标位点能否确定。实验室自己担负起RNA转录、构建cDNA文库的工作。完成3代测序、用化学方法测量分子间的相互作用力这些免疫研究实验室原本并不擅长的难题被团队逐个攻克。

　　按图索骥 摸索并掌握一套独有技术体系

　　根据已有发现，团队按图索骥，利用分子筛层析实验证实缺失lnc-Lsm3b表达的巨噬细胞在感染病毒以后，多聚化的RIG-I蛋白显着增加。他们推测，病毒RNA与RIG-I结合以后，能够诱导RIG-I单体形成多聚化状态，从而激活下游信号通路。而lnc-Lsm3b只与单体结合，可能是通过抑制RIG-I的多聚形成抑制RIG-I的活性。

　　“Lsm3b只能结合单体的RIG-I蛋白、一条链能结合9个蛋白、结合力比病毒RNA高……”这些都是对这个全新RNA分子的多角度了解。

　　如同向“黑洞”中打进一束光，曹雪涛团队在对现有知识体系颠覆的同时，肯定地回答了学界之前关于这类自身RNA分子是否存在、功能几何的争议。

　　“过去我们用别人的技术进行实验，现在我们自己摸索并掌握一套独有的技术。”曹雪涛说，整个研究的“练兵”不仅拓展了人类的“知识域”，还拓展了实验室的思路和眼界。接到《细胞》杂志编辑部发来修改要求时感受到的“不可思议”和巨大压力，团队成员现在已能笑谈。

　　“只是这段RNA与人类的同源性很低。”姜明红表示了小小的惋惜，这意味着，该发现无法直接应用于人类的新药创制领域，但是，其他拥有人源细胞材料的机构，可以沿着这条路，进一步发现人类机体内是否存在相似的RNA。曹雪涛更看重的是，确定靶点的方法一旦被高质量地掌握，就能够确定蛋白质的靶点，进而确定药物作用的靶点，助力抗病毒药物的研发。

　　相关报道：

　　非编码 RNA 存在“认知黑洞”，曹雪涛院

　　士团队发现一种全新非编码 RNA 分子

　　文章来源： 贤集网 发布时间：2018-05-08

　　在人类基因组中 95% 的基因并不编码蛋白质，其他物种也有大量的非编码基因。这些 DNA 不会被编码成蛋白质，却又会转录出非编码 RNA，它们对生命活动起什么作用？是进化的冗余还是神秘的缓存？细胞虽小，却瀚如乾坤。寻找一个不知道存不存在的 RNA 分子，如大海捞针。

　　《细胞》杂志近日刊登中国工程院院士曹雪涛团队的研究论文，他们发现一种全新非编码 RNA 分子。该分子能够调控免疫系统的“进”与“退”，这是此前学术界从未认识和证明的。

　　“由于长链非编码 RNA（lncRNA）丰度低，业界对其功能争议很大。”浙江大学生命科学研究院教授徐平龙在此前接受采访时评价道，但此次发表的研究严谨地鉴定了所发现的一种全新 lncRNA 是有功能的，即能够进行免疫调控，而曹雪涛院士正是这一机制的主要开拓者之一。

　　大海捞针 从浩淼细胞中层层筛选而出

　　细胞虽小，却瀚如乾坤。寻找一个不知道存不存在的 RNA 分子，如大海捞针。

　　到哪里找线索？病毒感染给了曹雪涛启示。谈到为什么会从病毒这个“敌人”的角度考虑。曹雪涛讲道：“我们中国文化讲，阴中有阳、阳中有阴，这是外国人很难理解的。这一哲理指导我们对免疫系统的理解就是，激活和抑制很可能会交融在一处，那么我们就从这个‘交融点’突破解题。”

　　既然体内蛋白能够识别外来的病毒 RNA，能不能识别体内自身 RNA 呢？

　　科学界大部分认为不能。“免疫系统拥有识别‘自我’‘非我’的能力，就好像边境卫士，对外来的侵害反应敏感，对辖内‘居民’熟视无睹。”曹雪涛院士团队成员之一、中国医学科学院基础医学研究所教授姜明红说，“但是曹老师并不这么看，他说，究竟是不是熟视无睹，你要证明才行。”

　　在中国传统哲理思想的指引下，曹雪涛锁定了一个已知的关键蛋白——“RIG-I”，求证这个能与病毒 RNA 结合的蛋白，会不会和体内自身的 RNA 分子结合。

　　RIG -I很像一个分子水平的“老鼠夹子”，2011 年有科学家解析了这个蛋白的分子结构，发现“老鼠（病毒 RNA）”没来的时候，夹子合着，两头的结构域相互作用，蛋白处于“闭合”状态；一旦“老鼠”来了，与夹子的一头结合，另一头就会“弹开”，蛋白遂处于激活状态。而这样的构象变化，会引发细胞合成出关键的抗病毒分子——干扰素，干扰素分泌后被周围细胞接受，引发抗病毒的“连锁反应”。

　　研究团队通过紫外加强 RNA 结合蛋白免疫沉淀（UV-RIP）的方法，将“老鼠夹子”和它猎捕的“老鼠”同时从细胞中分离出来。随后通过蛋白质变性等方法，把“老鼠夹子”过滤掉，就获得与 RIG -I 结合的所有 RNA。

　　夹子“钓”上来的所有 RNA 中，有没有未被发现的有功能的 lncRNA 呢？将“捞针”的范围锁定夹子“钓”上来的 RNA 后，团队又通过设计对应的干扰实验继续缩小范围，即看究竟哪个 RNA 被封杀之后，免疫活动不再被抑制。功能筛选帮助团队锁定了一批备选者并列出“排名”。排名靠前的 RNA 分子，且与特定信号通路相关的 lnc-Lsm3b 被锁定，一个新的 RNA 分子从浩淼的小鼠巨噬细胞中经过层层筛选被“打捞”上来，并获得了确切的序列。

　　团队后续开展了多角度的证明工作，如通过干扰、敲除、过度表达等技术，反复证明 lnc-Lsm3b 能够在病毒感染的细胞中，通过“分子诱饵”的方式锁定 RIG-I，使其不与病毒 RNA 结合。

　　海量实验 顶级期刊的尖锐难题被逐个攻克

　　全新的发现，使得团队兴奋异常。没想到的是，更大的磨砺还在后面。

　　团队向顶级期刊投稿，审稿人却要求必须用 CLIP（交叉互连免疫沉淀）技术明确 RNA 的哪一个点和蛋白质相互作用，连接在一起。用语言很难解释蛋白质和 RNA 在活体细胞内错综复杂的关联，姜明红给科技日报记者画图：一个长链 RNA 会结合多个蛋白，这些蛋白有的是特异连接，连得紧密，有的就是“挂”在上面，而蛋白之外还会带上其他的 RNA，“缠绕”“连带”“虚实”……

　　CLIP 很难做，国内实验室极少有成熟的经验。收到修改意见后的团队成员开始大量查阅论文。“国外的实验流程无法完全照搬，不同的细胞做法不同，需要重新摸条件。”团队中主要攻关这一技术的刘伦说。

　　CLIP 技术和 RIP（RNA 结合蛋白免疫沉淀）技术类似，但是却能够达到单个碱基的分辨率。为此，通过海量实验，针对裂解液的成分如何影响细胞内物质，团队开始了如指掌；不同 RNA 酶的脾气也熟练掌握。

　　“实验室的部分我们自己攻克了，但是测序公司表示无法进行匹配的测序工作，原因是无法合成特有的适当引物。”刘伦说，国内没有公司生产 CLIP 所需引物，而 RNA 测序必须先反转录为 cDNA 才能够进行，引物决定了反转录的准确性，决定了目标位点能否确定。实验室自己担负起 RNA 转录、构建 cDNA 文库的工作。完成 3 代测序、用化学方法测量分子间的相互作用力……这些免疫研究实验室原本并不擅长的难题被团队逐个攻克。

　　按图索骥 摸索并掌握一套独有技术体系

　　根据已有发现，团队按图索骥，利用分子筛层析实验证实缺失 lnc-Lsm3b 表达的巨噬细胞在感染病毒以后，多聚化的 RIG -I 蛋白显著增加。他们推测，病毒 RNA 与 RIG -I 结合以后，能够诱导 RIG -I 单体形成多聚化状态，从而激活下游信号通路。而 lnc-Lsm3b 只与单体结合，可能是通过抑制 RIG -I 的多聚形成抑制 RIG -I 的活性。

　　“Lsm3b 只能结合单体的 RIG -I 蛋白、一条链能结合 9 个蛋白、结合力比病毒 RNA 高……”这些都是对这个全新 RNA 分子的多角度了解。

　　如同向“黑洞”中打进一束光，曹雪涛团队在对现有知识体系颠覆的同时，肯定地回答了学界之前关于这类自身 RNA 分子是否存在、功能几何的争议。

　　“只是这段 RNA 与人类的同源性很低。”姜明红表示了小小的惋惜，这意味着，该发现无法直接应用于人类的新药创制领域，但是，其他拥有人源细胞材料的机构，可以沿着这条路，进一步发现人类机体内是否存在相似的 RNA。曹雪涛更看重的是，确定靶点的方法一旦被高质量地掌握，就能够确定蛋白质的靶点，进而确定药物作用的靶点，助力抗病毒药物的研发。

　　“过去我们用别人的技术进行实验，现在我们自己摸索并掌握一套独有的技术。”曹雪涛说，整个研究的“练兵”不仅拓展了人类的“知识域”，还拓展了实验室的思路和眼界。接到《细胞》杂志编辑部发来修改要求时感受到的“不可思议”和巨大压力，团队成员现在已能笑谈。