狂犬病实验诊断新方法：可能取代当前的金标准（DFA）

即将向全球推广的狂犬病实验诊断新方法----实时定量RT-PCR检测法（简称LN34检测法），可能作为狂犬病基本检测诊断方法，补充或取代当前的金标准：DFA检测。

动物和人狂犬病的确诊，必须要有实验室检测结果，否则都只能算疑似病例。

目前WHO（世界卫生组织）肯定的人和动物狂犬病的死后诊断的金标准，是直接荧光抗体（DFA）检测。

虽然DFA检测已被证明是敏感和可靠的，但目前在发展中国家，很难普遍开展DFA，因为需要昂贵的荧光显微镜、高技能的技术人员、特殊的高质量的抗体偶联物试剂，同时对样品质量有较高的要求。而发展中国家正是狂犬病风险最严重、对相关检测和诊断技术最需要的地区。

美国CDC的相关研究人员近年开发出广谱狂犬病毒实时定量RT-PCR检测法（简称LN34检测法）。今年5月16日，美国CDC联合全球7个国家14个实验室对LN34检测的协同评估数据（论文）已在PLOS One   上发表。原文全文下载：

Multi-site evaluation of the LN34 panlyssavirus real-time RT-PCR assay for postm.pdf。

LN34检测法的优势：

新的快速狂犬病检测方法可能革新狂犬病的检测和治疗。新的LN34检测比目前的DFA检测更简便、快捷和经济，兼有高度的敏感性和特异性，是动物和人狂犬病死后诊断方法的强有力候选者。

LN34检测能够检测狂犬病毒属中不同基因型的病毒RNA，具有很高的检测灵敏度。

国际性多实验室的协同评估，证明LN34检测是鉴定脑组织中狂犬病毒RNA的可靠方法。而DFA所用的关键试剂（抗体偶联物）在不同批次或制造商之间在特异性和背景上都会有差别，并且在不同实验室中使用不同的偶联物和不同的偶联物稀释液，使得难以制定标准化的DFA方案。

LN34检测需要实时PCR仪以及进行分子诊断检测的培训和经验。然而，全世界许多诊断实验室目前都已经在使用实时PCR检测方法进行各种传染病的常规诊断，LN34在现有的筛查流感、结核病和HIV的普通平台上就能方便地运行。所以实施此项新的狂犬病特异性检测所需的额外的成本和额外培训很少。 

LN34在检测狂犬病病毒遗传物质时所需的样品数量极少，即使在样品已经液化的情况下也是如此。此外，样本的状态并不影响检测的准确性，可供检测的样品包括新鲜、冷冻、已降解或已经石蜡固定的动物组织。而DFA只适用于检测新鲜冷藏的动物组织，这对于电力贫乏的地区而言是一个难题。 

该项研究的首席作者、美国CDC微生物学家吉甘特（Crystal Gigante)在新闻发布会上表示，“LN34检测法将有可能真正改变游戏规则。它能迅速检测出哪些人需要接受狂犬病治疗，哪些人无需接受治疗，既能及时拯救生命，也减轻了家庭的经济负担。” 因此，通过更好的检测法，可以避免类似现在让所有疑似感染狂犬病的人都要接受连续几周注射治疗的做法。新的检测方法可能有助于改善美国和资源贫乏国家的狂犬病检测。

目前，受到狂犬病影响最严重的非洲和亚洲许多国家的检测设施无法轻易判定咬人动物是否患有狂犬病。在这些国家，用于检测的设备和狂犬病疫苗供应通常只有在集中的城市地区才具备，从人被咬的地方可能需要旅行几天才能到达，狂犬病疫苗和免疫球蛋白的费用可能相当于几个月的工资。所以及时准确知道咬人的动物是否是疯动物是很有价值的信息。

LN34也是在美国进行相应检测所需要的。目前，如果狂犬病检测结果不确定，被咬的人（在美国主要是被各种野生动物咬伤的人）如果需要接受狂犬病暴露后预防（PEP），一个人所需处置成本通常超过3,000美元。 LN34可减少目前DFA检测常遇到的不确定和假阳性的情况，从而避免不必要的PEP。美国目前每年用于狂犬病检测、预防和控制的花费为2.45亿---5.1亿美元。每年约有40,000-50,000人在美国需要进行狂犬病PEP。

LN34检测法涉及的基本技术原理：

LN34采用的实时定量RT-PCR技术，是近十多年来迅速发展的一种通用的病原体检测技术。该技术平台在许多发展中国家都已广泛建立。在现有技术平台的基础上稍作调整，就能开展LN34检测工作。

LN34检测的对象是病毒RNA的单个链状分子，通过RT-PCR对原RNA进行反转录和扩增，与检测对象为病毒抗原（具复杂空间构型的蛋白大分子）的DFA相比，具有更高的灵敏度和结果的可重复性。

LN34检测法能够在单一检测装置中检测狂犬病毒属的各种基因型的病毒。LN34检测并扩增病毒基因组起始区域，该区域在不同狂犬病毒的前导序列和部分核蛋白（N）基因中是保守的。简并引物和多重锁定核酸 Taqman 探针的组合增加了测定的广泛反应性。引物和探针结合位点在狂犬病毒属中高度保守，并且使用一组包含88种不同的狂犬病毒分离株的实验曾验证了LN34测定的广泛适应性。

 LN34检测还包括一种人工RNA，可充当分析物阳性对照，允许跨实验室和不同实验批次之间进行标准化和优化，以确保检测灵敏度和重复性。

 LN34测定中还包括宿主物种对照β-肌动蛋白实时RT-PCR测定。其目标是宿主β-肌动蛋白mRNA（在哺乳动物物种中是保守的）。β-肌动蛋白测定可确保每个样品中存在RNA，并充当PCR抑制、提取失败或RNA降解的对照指标。

多实验室对LN34检测法进行协同研究的主要结果：

在最近的这项协同研究中，来自7个国家的14个实验室参加了研究，将LN34测定结果与金标准DFA检测的结果进行比较以估计诊断灵敏度和特异性。这项研究是迄今为止最大的验证这种类型的检测（实时RT-PCR）用于诊断动物狂犬病的尝试。对来自美洲、欧洲、非洲、亚洲和中东的近3,000个动物脑样品进行了评估，其中1,049个是DFA阳性。这些样本来自超过60种患狂犬病的哺乳动物，其中包括狗、浣熊、臭鼬、狐狸和蝙蝠。

LN34分析在重复性和再现性研究中表现出色，并且能够在多种类型的脑组织样本中检测到病毒RNA，这些样本包括已降解和福尔马林固定的脑组织。与DFA检测相比，LN34测定法用于狂犬病的诊断显示出准确率接近100%，特异性为99.68％，灵敏度为99.90％。LN34能将所有DFA阳性样本正确识别。

对于80份DFA未能确定结果或无法检测的样本，经LN34检测都产生了确定的结果;其中 29例是阳性的（！）。这说明当前公认的狂犬病检测诊断金标准可能是有重大缺陷的！

通过LN34测定的样品中有五个没有得到明确结果，只有一个样品是用两种方法都未能获得结果的。

LN34检测法主要参考文献全文下载：

除了本文开头介绍的在PLOS One上发布的相关论文外，另有若干已发表的相关论文也发布了LN34检测所用引物和探针序列，提供了详细的实验方案和诊断指南，可使检测标准化并可供世界各地的实验室免费使用。其中最有用的一篇相关论文：

A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Varia.pdf。

现在市场上出现了新型低成本便携式PCR诊断系统，进一步提升了相关检测在现场或偏远地区应用的潜力。

 关于狂犬病毒实验的生物安全要求，请参看本人的相关博文：狂犬病实验室的生物安全级别要求（http://blog.sciencenet.cn/blog-347754-1004913.html ）

新的狂犬病检测方法（LN34检测法）可能成为国际标准的一部分

LN34试验在确定几种特殊情况下的DFA检测结果方面发挥了作用。

LN34测定和DFA检测之间的不一致结果有助于判定一些实验室的系统问题。有两个实验