液相色谱串联质谱法检测食用油脂中苯并芘

苯并芘(Benzo(a)pyrene,BaP),又称3,4-苯并芘,是一种含5个环的稠环芳烃,分子式为C20H12,结构如图1所示。苯并芘常温下是黄色结晶,几乎不溶于水,可溶于苯、甲苯和环己烷,稍溶于乙醇和甲醇。苯并芘是最具有代表性的国际公认的强致癌物,可以通过呼吸、摄入和接触等途径进入人体,可损伤生殖系统,易导致皮肤癌、肺癌、上消化道肿瘤、动脉硬化和不育症等疾病。苯并芘在自然界中广泛分布,在油料加工和油脂生产中的不当操作以及苯并芘的亲脂能力可能使其污染食用油。GB2716-2005《食用植物油卫生标准》规定食用油中苯并芘含量的最高上限为10μg/kg。目前,食用油脂中BaP的分析方法主要有纸(板)图1苯并[a]芘的结构式色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用法。由于食用油成分复杂,其中苯并芘含量又极低,同时还存在着大量的干扰物质,因此无论使用哪种分析方法,都必须对样品进行分离、富集等处理。在GB2716-2005中,苯并芘按GB/T5009.27《食品中苯并[a]芘的测定》方法进行测定,测定方法是荧光分光光度法和目测比色法。这两种方法存在着操作复杂、溶剂毒性大、费时和准确度低等问题,以至于很难对油脂中苯并芘残留进行有效的检测。2008年,国家质检总局颁布了GB/T22509-2008《动植物油脂苯并芘的测定反相高效液相色谱法》,该测定方法采用的是液相色谱荧光检测方法,样品经填充的氧化铝柱子净化之后,再浓缩、检测。GB/T22509-2008测定方法的分析时间长、操作繁琐、溶剂消耗比较大,不同操作人员的数据差异比较大。随着分离和分析技术的发展,出现了商品化的固相萃取柱子,固相萃取与液相或者气相色谱-质谱联用技术已经应用于油脂中苯并芘的检测。与传统方法相比,固相萃取可以提高重复性、节约溶剂消耗,但是同样操作比较繁琐。因此,寻求并研究快速、准确的食用油中苯并芘检测技术具有十分重要的意义。吴海智等人建立了高效液相色图2在标准品(左)和样品中(右)苯并芘及其内标氘代苯并芘的色谱图谱法快速测定植物油中苯并芘的方法,油样经稀释、过滤以后直接进样分析。这种方法前处理简单,但是所需要的样品量比较大(2.5g),灵敏度低,且采用外标法进行定量。而采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测油脂中苯并芘的方法还未见报道。本文采用LC-MS/MS建立了食用油中苯并芘的测定方法,利用内标法进行定量,并且与国标方法进行了比较。结果显示:该方法灵敏、快速,适合于食用油中苯并芘的检测。1试验材料和方法1.1试验材料苯并芘标准品(纯度≥98%)、氘代苯并芘(d12-BaP,纯度≥98%),购自美国Supelco公司;乙腈、四氢呋喃、甲苯均为色谱纯,试验中所用水是去离子水。1.2试验仪器安捷伦1200液相色谱仪,配有G1329A自动进样器、G131lA四元混合泵和G1316A柱温箱,美国安捷伦公司;API5500三重四极杆串联质谱仪,配有光电离离子源(APPI)和Analyst1.5软件数据处理系统,美国应用生物系统公司;日立L-2130泵,日本日立高新技术公司;KQ-700DB型数控超声波清洗仪,昆山市超声仪器有限公司。1.3分析方法1.3.1标准溶液的配制储备液及工作液:用乙腈准确配制苯并芘(1g/L)和氘代苯并芘(1g/L)的一级单标储备液,储存于棕色玻璃瓶中,于-40℃下保存。分别准确量取一级单标储备液苯并芘(1mL)和氘代苯并芘(1mL)于2个10mL棕色容量瓶,用乙腈定容至刻度,得到二级单标储备液(100mg/L)。1.3.2样品前处理样品前处理参考先前报道的方法并做了适当的修改。即准确称取1.00g(精确到0.01g)油样于10mL容量瓶中,加入5mL四氢呋喃后,加入200μL的氘代苯并芘,然后用乙腈定容到10mL。放入超声仪中超声10min,然后过0.22μm的有机相滤膜,待测。1.3.3标准曲线绘制取7个10mL的容量瓶,依次加入2、5、10、20、50、100和300ng的苯并芘标准品,并且各加入200ng的氘代苯并芘,然后用乙腈定容至刻度,并且混匀,最终的浓度为0.2、0.5、1、2、5、10和30ng/mL(氘代苯并芘为20ng/mL)。按照1.4中的液相和质谱条件分析,以标准溶液浓度/内标的浓度为横坐标,标准溶液峰面积/内标的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。1.3.4回收率和精密度试验准确称取已测定苯并芘含量的油脂1g,分别加入低、中、高3个浓度的苯并芘标准品,按照1.3.2的前处理方法处理样品,并测定其苯并芘含量,每个水平重复5次,按下式计算回收率:回收率=(加入后样品中的苯并芘含量-样品中原来的BaP含量)/加入的苯并芘的量×100%选取低、中、高3个样品,在同1d内测定其含量5次,计算其平均值和RSD。1.4色谱-质谱条件色谱条件:Dionex ACCLAIM C18色谱柱(150mm×3mm,3μm);流动相∶水,乙腈溶液;柱温40℃;进样量5μL。掺杂剂甲苯,流速为100μL/min;洗脱条件∶乙腈∶水,95∶5(V/V),流速为550μL/min,分析时间为8min。质谱条件:光电离离子源,多反应监测,正离子扫描方式;点喷雾电压700V,雾化气75psi,气帘气15psi,辅助加热气50psi,温度600℃,射入电压10V,碰撞能9eV;去簇电压110V,驻留时间50ms。本试验中所采用的定量离子对为253.2→252.1,定性离子对为253.2→251.1,内标的离子对为265.2→263.1。2结果和讨论2.1色谱柱的选择考察了不同柱子对于苯并芘的分离效果。其中XTerra MS C182.5μm2.1×50mm柱子出峰太早,对于苯并芘几乎无保留;Aglent XDB-C183.5μm2.1×150mm即使乙腈比例达到100%,峰形也不是很好;ACQUITY U-PLC BEH C181.7μm2.1×100mm对于苯并芘的保留时间约为1.8min,但是由于实际样品比较复杂,无法和干扰物得到有效的分离。因此,最终选择Dionex ACCLAIMC18色谱柱(150×3mm,3μm),在1.4的色谱条件下,苯并芘和干扰物得到有效的分离如图2所示,且保留时间比较合适,样品中苯并芘的保留时间为4.03min,氘代苯并芘为3.85min。2.2超声时间的选择选取同一个样本,按照1.3.2的前处理方法处理样品,做6个平行,其超声时间分别为10、15、20、30、40和60min,过滤膜以后测定其苯并芘的含量,结果发现:苯并芘的含量并不随着超声时间的延长而增加,因此最终选择10min做为最佳的超声时间。2.3标准曲线和检测限苯并芘的标准曲线如图3所示,利用内标法进行定量分析,在0.2～30ng/mL范围内具有良好的线性关系。以信噪比(S/N)不低于3时的进样浓度为检测限(LOD),方法检测限为0.1ng/mL;以信噪比(S/N)不低于10时的进样浓度为定量限(LOD),方法定量限为0.3ng/mL。2.4回收率和精密度分别选取了0.5、5和20ng/mL3个添加水平做回收率,方法平均回收率范围为89.8%～102%,RSD(相对标准偏差)在1.48%～2.59%,具体分析测定结果见表1。图3苯并芘标准曲线表明方法对食用油分析具有良好的精密度和重复性。2.5方法对比利用建立的LC-MS/MS方法和GB/T22509-2008的方法对某品牌的食用植物油中苯并芘含量进行了测定,结果见表2。2个方法的相对标准偏差均小于5%,说明LC-MS/MS准确度良好,可以满足油脂中苯并芘含量快速测定的要求。3结论本研究建立了一种食用油中苯并芘检测的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法。方法前处理简单,重复性好,分析时间短,并且采用内标法进行定量,检出限为0.1ng/mL,平均回收率范围为89.8%～102%,能较好的满足食用油中苯并芘的快速检测需求。表1方法的回收率和精密度(n=5)样本含量(ng/mL)加标量(ng/mL)检测(ng/mL)平均回收率(%)相对标准偏差(%)0.150.500.6192.01.480.155.005.27102.01.580.1520.018.189.82.59表2LC-MS/MS方法和GB/T22509-2008方法测定结果比较序号GB/T22509-2008方法(μg/kg)LC-MS-MS方法(μg/kg)相对标准偏差(%)18.138.140210.39.74.2312.612.81.141514.23.953.944.082.5616.616.21.7液相色谱-串联质谱法检测食用油脂中苯并芘@刘玉兰$河南工业大学粮油食品学院 @张小涛$河南工业大学粮油食品学院 @赵欢欢$河南工业大学粮油食品学院建立了一种食用油中苯并芘的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测方法。油脂经稀释以后直接进入LC-MS/MS分析。方法线性范围为0.2～30ng/mL,检出限为0.1ng/mL,平均回收率范围为89.8%～102%,RSD(相对标准偏差)在1.48%～2.59%。该方法能准确、快速和灵敏的检测食用油中的BaP。