深度解读荧光定量PCR仪所运用的技术

 　　深度解读荧光定量PCR仪所运用的技术

　　荧光定量PCR仪所用到的实时荧光定量PCR技术是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，而实现对起始模板定量及定性分析的目的。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图，达到监测PCR产物扩增量的目的。

　　一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；而在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，因此根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，故选择该阶段进行定量分析。为了较方便的进行DNA拷贝数的定量，在实时荧光定量PCR技术中引入了三个非常重要的概念：基线、荧光阈值和Ct值。

　　基线：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近于一条直线，该直线即是基线。

　　荧光域值：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR反应3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

　　Ct值：表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标难曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

　　荧光定量PCR仪的实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外还可以对PCR产物或样品进行定性分析，利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域，其中最主要的应用集中在以下几个方面：

　　1.DNA或RNA的jue对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

　　2.基因表达差异分析。如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。

　　3.基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。