狙击艾滋病毒――“引蛇出洞”还是“关门打狗”？

　　曾庆平

　　有很多非专业或跨专业人士对于人类为何数十年攻克不了艾滋病难题感到迷惑不解，那是因为他们不太了解艾滋病毒致病的“特洛伊木马”机制。

　　艾滋病毒之所以能“摧毁”人类的免疫系统，是因为它们专门感染并杀死免疫细胞。不过，只要它们在免疫细胞内复制并产生新的病毒，人体都能立即识别它们并设法围歼之，如体液免疫(抗体)和细胞免疫(细胞因子)。

　　可恶的是，有些病毒进入免疫细胞后并不复制，而是藏匿起来等待时机，一旦时机成熟，它们就会从“木马”中苏醒过来并发起疯狂反扑，直到逐渐摧毁人体的免疫系统，最后将人置于死地。

　　那么，病毒为何如此聪明，竟然知道见机行事呢?其实，并不是它们有多聪明，只不过它们因为“误入”静息淋巴细胞而没有办法繁殖后代，只有等到静息淋巴细胞被激活成活跃淋巴细胞后，它们才能“倾巢而出”搞破坏。

　　艾滋病之所以难治，是因为潜伏病毒惹的祸!现在艾滋病患者服用的抗艾滋病毒药物(蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂)都可以杀死血液中的游离病毒，但对静息淋巴细胞中的潜伏病毒却无能为力!

　　正如自然界中某些生物特有的“假死”本能一样，只要猎物一动不动，猎食者就难以发现它们。猎食者唯一能做的就是“守株待兔”——小样，你总不可能一直装死吧!最后的胜利者究竟是谁，要看谁有足够的耐性!

　　人体依赖免疫细胞剿灭艾滋病毒，最初敌我双方势均力敌，你生产多少病毒，我都可以全部杀死。但是，不幸的是，艾滋病毒在潜伏过程中经过“乔装打扮”(基因突变)一番后，就能躲过免疫卫士的视线而逃之夭夭，进而重新为非作歹。

　　因此，要把隐患消灭在萌芽状态之中，可以采取两种策略，一种是在潜伏病毒还来不及“伪装”之前就把它们撵出来“斩首”，可以形象地称之为“引蛇出洞”策略;另一种是把房门紧锁并用铁链套住不让它们出门捣乱，可以形象地称之为“关门打狗”策略。

　　前一个策略已经用过多年，一般是使用淋巴细胞激活剂，在使淋巴细胞被激活的同时，也能激活潜伏病毒，再用药物杀灭活化的病毒。可是，现在看来，这种貌似可以根除潜伏病毒的策略并不像预期的那样有效，究其原因可能是因为被激活的病毒还可能感染新的静息淋巴细胞。

　　最近《每日科学》(Science Daily)登载了两篇关于激活艾滋病毒的科普文章，有兴趣的读者可以读一读，特别建议学化学及从事新药研发的人看看：

　　Closer to a Cure? Chemists Synthesize Compound That Flushes out Latent HIV

　　(http://www.sciencedaily.com/releases/2012/07/120717141233.htm)

　　New Approach To Targeting The Hidden Reservoir Of HIV

　　(http://www.sciencedaily.com/releases/2009/10/091001181041.htm)

　　后一个策略还很少应用，最早时有人设想使用甲基化试剂封闭艾滋病毒的转录起始区，但由于一直找不到特异性甲基化修饰剂而无法实施。因此，如果谁能将艾滋病毒永久钝化在淋巴细胞内，谁就有可能最终制伏艾滋病。

　　我们想到了一个“妙计”，准备在这里拿出来献献丑，非专业人士可能看不懂，但它或许能给专业人士提供一点启发，起到抛砖引玉的作用。

　　【摘要】

　　高效抗逆转录病毒疗法(HAART)只能降低人免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)感染者的血液病毒载量，HAART配合病毒活化方案也无法清除潜伏病毒，因此有必要及时调整抗HIV-1感染及艾滋病治疗策略。HIV-1感染CD4+T细胞后转变成CD4+T记忆细胞或病毒基因组整合到静息CD4+T细胞染色体是病毒潜伏的必要条件，转录因子缺乏和病毒基因不能转录则是病毒潜伏的根本原因。为了模拟HIV-1潜伏的细胞环境，我们拟利用 RANTES/SDF-1和抗CD45RA/CD45RO抗体偶联基因药物，经Ex vivo导入HAART治疗的艾滋病猴体内，通过结合CCR5/CXCR4和CD45RA/CD45RO靶向导入静息CD4+T细胞。通过LTR基因敲除抑制病毒复制、反义IL-7R RNA阻断潜伏感染细胞增殖、Tat结合LTR诱导活化感染细胞自杀等“多保险”策略，永久钝化潜伏病毒，减少病毒复制传播，甚至清除潜伏病毒库，以便为艾滋病患者提供新的HAART补充疗法。

　　【全文】

　　艾滋病(AIDS)是一种主要由人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)感染所引起的致命性传染病。虽然经过近30年的研究早已阐明艾滋病的发病机理，但至今仍未能彻底征服它，成为严重危害人类健康和生命的重大疾病。2009年11月24日，联合国艾滋病规划署在上海公布《2009年艾滋病流行报告》和《2010年艾滋病防治前景展望》，根据最新数据显示，艾滋病流行至今，全球大约已有6000万人感染了HIV-1，2500万人死于艾滋病相关疾病。 2008年，全球估计有156亿美元用于艾滋病的防治。联合国艾滋病规划署估计，2010年这一需求将上升至250亿美元。

　　2008年9月，默克公司联手美国过敏与传染病研究所主持的艾滋病疫苗实验宣告失败，诺贝尔医学奖获得者、著名艾滋病专家David Baltimore在美国科学促进会年会上致辞时指出：“基于HIV-1复杂的变异性，研究者们至少在25年或30年之内不可能找出有效的、适用于人类的艾滋病疫苗来，甚至人类可能永远也找不到这种疫苗”。尽管这种观点过于悲观，但预示着艾滋病疫苗的研制工作及临床应用任重而道远。2009年9月26日，美国-泰国艾滋病疫苗合作研发小组宣布，他们研制的艾滋病疫苗能让接种者的感染风险降低31.2%。临床试验结果显示，该疫苗接种后并未追踪到抗HIV- 1抗体以及识别并杀灭HIV-1的T细胞。实际上，在51名接种疫苗后感染HIV-1的志愿者体内，病毒的繁殖程度与未接种者几乎没有区别。世界卫生组织和联合国艾滋病规划署发表声明表示，作为有效疫苗应该至少能将感染风险降低50%以上，仅仅基于目前的试验结果，还不能批准生产这种疫苗。

　　可喜的是，相对于艾滋病疫苗的艰辛历程，艾滋病的药物治疗已经取得很大进展。自从美国洛克菲勒大学艾伦戴蒙德艾滋病研究中心行政总裁、清华大学艾滋病综合研究中心主任、美籍华裔学者何大一(David Ho)于1996年首创“鸡尾酒疗法”即现在的“高效抗逆转录病毒疗法”(HAART)以来，已利用17种逆转录酶抑制剂(包括13种核苷类逆转录酶抑制剂及4种非核苷类逆转录酶抑制剂)和11种蛋白酶抑制剂的选择性组合给药方案，通过选择性抑制病毒生活史的不同阶段(侵入、逆转录、整合、成熟)，可以让大部分HIV-1感染者不再出现病毒血症，艾滋病患者的死亡率降低了60%-80%。由于接受抗病毒治疗后患者生命得以延长，加上人口数量的增长，目前 HIV-1感染者的数量比以往更多，然而因为更多人获得了治疗，艾滋病相关疾病的死亡人数在过去5年里下降了10%以上。联合国艾滋病规划署和世界卫生组织估计，自1996年HAART治疗方案问世以来，挽救了大约290万人的生命。

　　正当人们庆幸艾滋病可能被彻底征服的时代即将来临之际，美国约翰霍普金斯大学医学院霍华德休斯医学研究所的著名艾滋病专家Robert F. Siliciano在Nature Medicine撰文指出，尽管HAART能使HIV-1感染者体内的病毒载量降低到检测阈值以下(即<50拷贝/细胞)，但却不能完全杀灭静息 CD4+T细胞中的整合原病毒(Siliciano et al. 2003)。HAART治疗期间可见4种动态病毒血症：(1)高速清除期：HIV-1感染的活化CD4+T细胞的清除，此类细胞的半衰期仅为1天;(2)中速清除期：HIV-1感染的巨噬细胞、部分活化的CD4+T细胞和滤泡树突状细胞(FDC)的清除，此类细胞的半衰期约为1-4周;(3)慢速清除期：半衰期约为39周的其他HIV-1感染细胞的清除;(4)稳定期：HIV-1在静息CD4+T细胞中稳定保持而不能被清除。据测算，静息CD4+T细胞的半衰期在44个月以上，人体中这类细胞的总数约为100万个，从HIV-1感染者体内完全清除病毒库的时间长达60-70年(Geeraert et al. 2008)。这就意味着HIV-1感染者将终身携带病毒，因而必须终身服药，这给病人、家庭和社会造成沉重的经济负担，而药物导致的严重副作用可能迫使患者中途放弃药物治疗。更令人担忧的是，在服药期间病毒发生抗药性突变后，患者将面临无药可救的致命后果。

　　毋庸置疑，全世界的科学家们都已经清醒地认识到，静息CD4+T细胞中潜伏病毒的存在就是艾滋病无法治愈的关键所在!为了清除潜伏病毒库，人们提出了各种各样的治疗方案，最初提出的方案是利用T细胞激活剂(如IL-6 + IL-2 + TNF-α、IL-2 + 抗CD3单克隆抗体OKT3等)使携带整合原病毒的静息CD4+T细胞激活，同时配合HAART清除产生活化病毒的CD4+T细胞。可是，临床试验结果表明，T细胞激活联合HAART并不能清空病毒库，停药2-3周后病毒就立刻出现反弹。同时，T细胞的非特异性激活还给志愿者带来严重副作用，甚至出现短暂失明和心脏病突发等危急状况(Margolis and Archin 2006)，迫使研究者不得不考虑只激活病毒而不激活T细胞的新方案(Siliciano et al. 2007)。为此，先后有人尝试用蛋白激酶C(PKC)拮抗剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂等进行临床试验(Reuse et al. 2009)。可是，几年过去了，各种治疗方案都未在临床上取得实际疗效。有人断言，现有方法不可能清除HIV-1感染者体内的潜伏病毒(Marcello 2006)。

　　为什么病毒活化配合HAART仍不能清除潜伏病毒库呢?最近在J. Virol上发表的1篇最新文章也许为回答这个问题提供了新线索。该论文证实，HIV-1不仅可以生产性感染激活的CD4+T细胞，而且病毒基因组还能直接整合到静息CD4+T幼稚细胞和记忆细胞染色体上，尽管它们在幼稚细胞中的整合效率远低于记忆细胞(Dai et al. 2009)。于是，经过病毒活化处理后，大量子代病毒将从感染细胞中释放出来，又造成更多静息CD4+T细胞感染，再加上一部分病毒感染的CD4+T细胞转变成携带整合原病毒的CD4+T记忆细胞，从而造成潜伏-活化-感染-再潜伏的恶性循环。其次，全身非特异性给药也可能是重要原因之一，因为静息 CD4+T细胞的数目非常少(100万个)，而携带潜伏病毒的静息CD4+T细胞更少(淋巴结内仅有5/100万，血液中仅有7/100万)，非靶向给药显然难以让如此稀少的病毒潜伏细胞摄取到足以杀灭病毒感染细胞的药物浓度。此外，某些表观基因治疗药物在激活病毒的同时，也可引起诸多副作用，如PKC拮抗剂阻断正常细胞的转录因子信号转导、HDAC抑制剂影响所有基因的正常功能、DNMT抑制剂促进原癌基因表达等，都会使潜伏病毒库的机体免疫及化学药物清除复杂化。

　　既然病毒活化策略不能奏效，那么是否可以考虑抑制整合病毒的活化呢?实际上，潜伏感染就是病毒在特定时空环境中的一种钝化形式，只不过钝化周期很短，一旦细胞被激活，原病毒基因便开始表达，新的子代病毒也将产生出来。如果能够模拟病毒潜伏的条件，让整合病毒基因组在染色体上永久沉默，就能使病毒潜伏感染细胞不再出现生产性感染直至死亡。国际人类基因组测序团队(IHGSC)早期发表的研究报告指出，从人类基因组的进化史来看，失活的转座子和病毒作为“进化遗迹”其实大量存在于现代人类基因组中，而且很多人类基因都是从这些外来基因进化而来的(IHGSC, 2001)。有趣的是，刚刚在Nature杂志上发表的一篇最新报道宣称，人类8%的遗传物质来自Borna病毒，暗示病毒基因组可以通过所谓“内生化” 过程被人类基因组“同化”(Feschotte 2010)。

　　为了人工钝化HIV-1，应当了解病毒潜伏的机理以及病毒活化的诱导因素。过去一直怀疑HIV-1长末端重复(LTR)上CpG岛的甲基化修饰可能是导致病毒潜伏的原因，因为类似的相关性在人T细胞白血病病毒1型、Moloney鼠白血病毒、劳斯肉瘤病毒、人内源性逆转录病毒H、K、W家族等逆转录病毒感染中已有报道。可是，2009年8月由法国、美国、比利时和捷克科学家组成的研究团队在PLoS ONE上发表文章指出，LTR中CpG岛的高度甲基化并不能阻止HDAC抑制剂(NaBut、TSA、SAHA、apicidin)、PKC拮抗剂(PMA、prostratin)、细胞因子(TNF-α)和DNMT抑制剂(5-aza-dC、zebularine)诱导的病毒活化(Blazkova et al. 2009)，但LTR甲基化可能负责病毒潜伏的维持而不是建立。在HIV-1长期感染的U937细胞和潜伏感染的ACH-2细胞系中，CpG甲基化的确被认为是病毒潜伏的维持机理(Kauder et al. 2009)。由于HIV-1基因组突变频繁，宿主细胞对病毒基因组的主动甲基化造成的碱基错配并不能阻止病毒繁殖。因此，DNA甲基化可能是人体抵抗 HIV-1感染的失败防御机制之一。

　　限制性染色质的形成也被认为是病毒潜伏的另一个可能原因，因为HIV-1进入潜伏状态需要HDAC-1、组蛋白甲基转移酶HMTSuv39H1和异染色质蛋白HP-1结合到LTR所在的染色质上。然而，有人反驳说，HIV-1感染者的静息CD4+T记忆细胞中整合的原病毒90%以上都位于表达活跃的基因中，不太可能形成抑制病毒转录的所谓“组蛋白密码”(Han et al. 2004)。2009年，美国阿拉巴马大学的研究人员在J Virol上发表文章认为，组蛋白去乙酰化和DNA甲基化等表观遗传控制模式对于病毒潜伏状态的建立都不重要，因为HDAC抑制剂或DNMT抑制剂并不能阻止病毒潜伏(Duverger et al. 2009)。

　　另外，还有其他因素也可能促进HIV-1潜伏。Huang et al. (2007)在Nature发表文章指出，静息CD4+T细胞中miRNA(miR28、miR125b、miR150、miR223、miR382)的丰度显著高于CD4+T细胞，表明细胞miRNA可能通过RNAi促进病毒潜伏状态的建立或维持。Chiu et al.(2005)在Nature上报道，静息CD4+T细胞可通过APOBEC3G(A3G)蛋白的作用阻断HIV-1感染，而T细胞激活能消除A3G 对HIV-1感染的抑制作用。不过，PLoS ONE发表的最新研究结果却得出否定的结论，即敲除A3G基因的静息CD4+T细胞仍能抵抗HIV-1感染(Santoni and Trono 2009)。

　　2009年12月，比利时自由布鲁塞尔大学的研究人员在Retrovirology发表综述，将HIV-1潜伏区分为整合前潜伏和整合后潜伏2大类型，并总结了导致整合后潜伏的5种可能因素：(1)整合位点，包括空间位阻、启动子冲突和增强子陷阱;(2)感染细胞中转录因子的丰度;(3)启动子上染色质的组成;(4)病毒Tat蛋白及Tat结合因子;(5)miRNA与RNAi(Colin and Van Lint 2009)。由此可见，病毒潜伏是一个受多因素影响的过程，涉及到病毒与感染细胞之间复杂的相互作用。但是，导致病毒潜伏的核心因素还是病毒基因表达受阻，即病毒是否潜伏取决于病毒感染发生时宿主细胞中转录活性的高低，病毒进入转录因子缺乏的静息CD4+T幼稚细胞及记忆细胞或者病毒感染的CD4+T细胞部分转变成静息CD4+T记忆细胞，导致病毒反式活化蛋白Tat不能合成，于是病毒进入潜伏状态。

　　为了阻断HIV-1基因表达，首先应防止病毒“盗用”宿主细胞转录因子。NF-kB是激活HIV-1基因表达的主要转录因子，它在未激活的病毒感染细胞中通常与抑制性亚基IkB结合而滞留在细胞质中。当病毒感染细胞被激活后，NF-kB就从IkB分离出来并转位到细胞核内，通过结合病毒LTR区U3核心增强子中2个保守的kB位点启动病毒基因表达。澳大利亚研究人员曾尝试用21个核苷酸的siRNA靶向作用于HIV-1LTR的NF-kB结合位点，结果使慢性感染MAGIC-5细胞的生产性感染长时间受到抑制(至少30天)(Suzuki et al. 2005)。不过，由于HIV-1的高度变异性，利用siRNA结合LTR阻断病毒复制存在很大风险。一旦LTR的NF-kB位点发生碱基突变，siRNA的抑制作用就会立即失效，除非重新针对突变靶点设计新的siRNA(Rossi 2006)。

　　于是，NF-kB抑制剂便成为阻断病毒复制的重要选项之一。最经典的NF-kB抑制剂是吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)。最近报道，药用植物肉桂中的苯酸钠也能抑制NF-kB活性(Brahmachari et al. 2009)。我国科学家不久前发现，青蒿琥酯可通过抑制NF-kB活性及PI3激酶/Akt信号转导途径阻断TNF-α诱导的促炎症细胞因子(IL-1、 IL-6、IL-8)合成(Xu et al. 2007)。众所周知，青蒿素及其衍生物(青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等)是非常有效的抗疟药，但它们能否通过抑制NF-kB活性阻断HIV- 1复制尚未见报道。

　　在利用NF-kB抑制剂之前必须先解决以下2个问题：①NF-kB并不是HIV-1依赖的唯一转录因子。Robert F. Siliciano所在的研究小组最近在PNAS发表论文指出，潜伏病毒活化除涉及NF-kB转录因子依赖途径外，还涉及Ets-1转录因子异位剪接分子(ΔVII-Ets-1)依赖途径(Yang et al. 2009)。实际上，根据以往的研究结果，HIV-1可利用通用转录因子(Sp1、TFIID等)和诱导转录因子(NF-kB、NFAT、AP-1等)启动基因转录。因此，仅仅采用某种特异性转录因子抑制剂不可能完全阻断HIV-1复制。②转录因子也是宿主细胞中正常基因表达所必需的，如NF-kB在调节机体免疫反应中具有重要作用，若正常细胞中转录因子合成受阻或活性被抑制都将导致细胞功能异常甚至致死。

　　另一方面，HIV-1的Tat蛋白可通过激活转录延伸过程促进全长病毒基因组的合成，由LTR开始转录产生大约100个核苷酸后，Tat便结合上来，从而大大提高转录效率(至少1000倍)。因此，Tat蛋白合成的抑制也是阻断病毒基因表达的重要环节之一。Hoffmann-La Rothe公司是Tat抑制剂研发的先驱。1991年该公司科研人员在Science上发表文章, 首次报道苯二氮类化合物Ro5-3335和Ro24-7429可抑制Tat介导HIV-1的反式激活，其中Ro24-7429还曾进入I期临床试验，但后因疗效不理想并且有神经毒性而中途放弃。最近，澳大利亚的研究人员在PLoS ONE报道，一种突变型Tat蛋白——Nallbasic能同时抑制反式激活、Rev依赖的mRNA转运和逆转录，从而阻断HIV-1的复制(Meredith et al. 2009)。

　　最近，法国科学家研究发现，中心T记忆细胞(TCM)和T过渡细胞(TTM)是HIV-1感染者体内主要的潜伏病毒库，通过白细胞介素-7(IL-7)及低水平抗原刺激的T细胞增殖，潜伏病毒可以长期存在于HIV-1感染者体内(Chomont et al. 2009)。葛兰素史克(上海)研发中心的研究人员最近在Nature Medicine发表的论文指出，IL-7受体(IL-7R)拮抗可抑制JAK-ATAT5信号转导途径，并改变促存活蛋白Bcl2与促凋亡蛋白Bax的表达模式(Liu et al. 2010)。因此，可选择IL-7R siRNA、IL-7R反义RNA或JAK抑制剂阻断HIV-1感染T细胞的增殖。

　　根据上述研究结果，我们拟将艾滋病治疗策略由病毒活化配合HAART治疗调整为先用HAART消除病毒血症，留下仅含有整合原病毒的静息CD4+T细胞，然后通过基因治疗使静息CD4+T细胞中的原病毒永久钝化。为此，本项目将首先利用SIVmac251毒株感染的CEMx174细胞系评价基因治疗药物及其组合物强制钝化整合原病毒的效果。体外研究的具体内容包括：(1)构建LTR基因打靶及IL-7R反义RNA表达载体，完全敲除整合原病毒的LTR序列，杜绝病毒复制及基因转录，并抑制IL-7与IL-7R的相互作用，阻断感染的静息CD4+T细胞活化与增殖;(2)建立Tat诱导的自杀基因表达系统，防止新病毒感染造成的原病毒重组复活。

　　基因打靶/IL-7R反义基因表达载体由SIV LTR左侧序列-CMV启动子-IL-7R反义基因-SIV LTR右侧序列组成，此外还含有病毒包装识别序列φ和RRE序列，其中LTR的左、右侧序列可通过双交换替换病毒LTR，将CMV启动子-IL-7R 反义基因整合在LTR所在的位置。在CMV启动子驱动下，该嵌合基因可转录生成IL-7R 反义RNA，抑制IL-7介导的整合SIV静息CD4+T细胞分裂与增殖，防止病毒在细胞间逐代传播。即使基因打靶/IL-7R反义基因表达载体被导入非感染的CD4+T细胞，由于无同源序列而不会发生基因重组，因此不会抑制正常CD4+T细胞的分裂，可以起到选择性增殖抑制作用。

　　Tat诱导自杀基因表达系统由Tat诱导表达载体和前药共同组成。Tat诱导自杀基因表达载体含有SIV LTR序列控制的细胞色素c(Cytc)cDNA;前药包括亚麻酸和双氢青蒿酸(DHAA)。Tat诱导合成的Cytc可催化亚麻酸释放单线态氧(1O2)(Koga et al. 1991)，1O2可促进DHAA转变成青蒿素(Guo et al. 2010)，青蒿素则通过多种机制(包括抑制NF-kB活性)诱导细胞凋亡。在前期研究中，我们用10μM青蒿琥酯和相同浓度的DHAA分别处理 SIVmac251感染的CEMx174细胞，经过48h孵育后，青蒿琥酯共培养细胞在未出现病变以前就全部死亡，而DHAA共培养细胞继续生长并产生病变。

　　在非感染的CD4+T细胞及未被激活的静息CD4+T细胞中，自杀基因中从LTR开始的基础转录受到负转录延伸因子(N-TEF)包括负延伸因子(NELF)及DRB敏感性诱导因子的抑制。因此，LTR控制的cytc基因不表达，DHAA不能转变成青蒿素，细胞正常生长。相反，在病毒生产感染细胞中，LTR在Tat诱导下可募集正转录延伸因子(P-TEF-b)到启动子上解除N-TEF对转录延伸的抑制(Unwalla et al. 2006)。cytc基因表达合成Cytc，催化1O2释放及青蒿素生成，导致细胞凋亡。

　　在体内实验中，如何将上述基因治疗药物靶向导入HIV- 1感染的CD4+T细胞以及HIV-1潜伏的静息CD4+T细胞呢?HIV-1主要感染CD4+细胞(T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)，病毒侵入 CD4+细胞主要依赖CD4，同时还要借助各种辅助受体，其中巨噬细胞嗜性病毒依赖CCR5受体，而T细胞嗜性病毒依赖CXCR4受体。T细胞表面还表达蛋白质酪氨酸磷酸酶受体C(PTPRC)即CD45抗原，其中CD45RA特异表达在幼稚T细胞表面，CD45RO特异表达在记忆T细胞表面。如果利用 CCR5/CXCR4的天然配基RANTES/SDF-1偶联化学药物或基因治疗药物，就能通过受体-配基相互作用将药物靶向导入T细胞、巨噬细胞、树突状细胞。若用抗CD45RA/CD45RO抗体偶联药物，则可通过抗原-抗体相互作用将药物靶向导入静息CD4+T细胞。但是，目前尚未见趋化因子或抗 CD抗体作为药物载体治疗艾滋病的报道。早前曾经报道，人乳头瘤病毒-16(HPV16)L1抗原基因(Kim et al. 2003)及流感病毒血凝素基因(Williman et al. 2008)与RANTES基因融合曾被用来增强DNA疫苗的免疫原性;胞内趋化因子(intrakine)RANTES基因表达(Yang et al. 1998)或抗CCR5胞内抗体(intrabody)基因表达(Swan et al. 2005)可下调细胞表面CCR5/CXCR4密度，从而抑制HIV-1进入感染细胞。

　　利用趋化因子偶联大分子药物(如蛋白质或核酸)的困难之一是所制备的复合物分子量巨大，在体内可能被各种组织吸附而很难到达靶点部位。因此，我们拟放弃采用通常的“体外直接偶联法”，建立“体内自动偶联法”。这种方法是分别构建“弹头药物”和导向分子的基因表达载体，通过生物素与亲和素的结合而使“弹头药物”与导向分子自动偶联，其中“弹头药物”是用PCR添加生物素标记尿苷酸的基因打靶/IL-7R反义基因表达载体和Tat诱导自杀基因表达载体，导向分子为亲和素基因-RANTES/SDF-1基因融合表达载体。采用基因治疗中常用的Ex vivo技术将上述基因治疗药物离体导入猴外周血CD4+T细胞并回输猴体内后，细胞内基因表达系统合成并释放的生物素标记基因表达载体就与亲和素 -RANTES/SDF-1自动结合。这种方法的最大优点是给药时只是将分子量较小的质粒DNA离体转染到CD4+T细胞中，而不是导入分子量巨大的超分子蛋白质复合物。同时，利用感染细胞的裂解特性，还能将这种“假病毒”被包装后不断“感染”新的CD4+T细胞。

　　至于2种前药的靶向给药，我们将仿照“抗体导向酶前药疗法”(ADEPT)的原理，建立“CD45RA/ CD45RO抗体偶联亚麻酸及DHAA酶前药疗法”。抗体与小分子前药的连接采用碳化二亚胺偶联法。碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。此法非常简便，只要将半抗原与载体蛋白质按一定分子比混合在适当的溶液中，然后加入碳化二亚胺，搅拌l- 2h，置室温反应24h，最后透析除去未反应的半抗原，即可得到人工免疫原。

　　可以预见，基因敲除/IL-7R反义RNA靶向静息CD4+T细胞钝化潜伏病毒，Tat诱导LTR-cytc嵌合基因靶向清除病毒活化CD4+T细胞。整合病毒基因组中LTR基因敲除可确保病毒不能转录和复制;IL-7R基因反义抑制可阻断IL-7诱导静息CD4+T细胞增殖。一旦外来病毒与整合病毒重组，病毒基因将重新表达，由此产生的Tat可活化无细胞毒性的青蒿素前体产生有细胞毒性的青蒿素，导致病毒感染细胞死亡，杜绝病毒在体内的扩散。

　　本项目提出的艾滋病靶向基因治疗“多重保险”策略，目前国内外均未见报道。它是在HAART消除病毒血症的基础上，通过靶向静息CD4+T细胞钝化潜伏病毒及清除潜伏病毒活化的CD4+T细胞。如果该研究方案的可行性得到初步证实，那么将为艾滋病治疗方案的制定提供新的思维。当前，在清除潜伏病毒库的尝试遭遇困难之际，通过调整思路，改变策略，以“病毒钝化”代替“病毒活化”，也许可以为化解艾滋病治疗的困局找到一个突破口，同时还可能为无病毒血症的 HIV-1携带者提供一种辅助HAART的新疗法。